Multiplex-RT-PCR-ELISA

Präsentation zum Thema: "Multiplex-RT-PCR-ELISA"—  Präsentation transkript:

1 Multiplex-RT-PCR-ELISA
© W. Puppe

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3 Akuten Infektionen des Respirationstraktes
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Mikrobiologische Labor der Kinderklinik Nachweis von Erregern bei Akuten Infektionen des Respirationstraktes © W. Puppe

4 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - Nachweis viraler RNA durch reverse Transkription mit anschließender Polymerase Chain Reaction © W. Puppe

5 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer Zielsequenz (RNA) Reverse Transkriptase © W. Puppe

6 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer ACGGTCTTG Zielsequenz (RNA) © W. Puppe

7 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTA Zielsequenz (RNA) © W. Puppe

8 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe ERGEBNIS c-DNA Primer ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTACACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGT © W. Puppe

9 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 1 Kopie c-DNA © W. Puppe

10 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction c-DNA denaturieren bei 94°C © W. Puppe

11 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction c-DNA denaturieren bei 94°C © W. Puppe

12 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction annealen von spezifischen Amplifikations-Primern an Einzel-Strang 50°C 5‘ 3‘ Primer 2 Primer 1 © W. Puppe

13 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 CA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

14 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 CTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

15 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C 1. Zyklus 1 Kopie Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

16 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Denaturieren 94°C 2. Zyklus 5‘ 3‘ TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA © W. Puppe

17 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Denaturieren 94°C 2. Zyklus 3‘ 5‘ TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA © W. Puppe

18 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction annealing der Primer 50°C 2. Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 d-ATP; d-CTP; d-GTP; d-TTP Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

19 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 TGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

20 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 CATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

21 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

22 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 2ten Zyklus 2 Kopien 5‘ 3‘ CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

23 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 94°C CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

24 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 50°C Primer 2 Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

25 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 72°C Primer 2 ACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 ACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

26 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 72°C Primer 2 ACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 ACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

27 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 4 Kopien nach 3tem Zyklus 72°C Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

28 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 4ten Zyklus 8 Kopien CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

29 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 5ten Zyklus 16 Kopien © W. Puppe

30 Nachweis von Erregern mit eines Fragmentes welches auf der Zielsequenz
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction in der Praxis erhält man nach 21 bis 31 Zyklen 106 bis 109 Kopien eines Fragmentes welches auf der Zielsequenz mit einem hoch spezifischen Primer Paar amplifiziert wurde © W. Puppe

31 Multiplex-RT-PCR Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR Multiplex-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Verwendung von Primer Paaren die spezifisch für hoch konservierte Zielsequenzen der 19 Erreger sind in einem RT-PCR-Ansatz © W. Puppe

32 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR m-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction - Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel 2% Agarose 501 404 331 242 190 147 140 bp 3. entero virus (154) 4. M. pneumoniae (277) 5. Inf A (190) 6. Inf B (249) 1. standard 2. negative controle 7. adenovirus (134) 8. C. pneumoniae (463) 9. PIV1 (179) 10. PIV3 (205) 11. RSV (239) 12. B. pertussis 13. B. parapertussis Ergebnis einer m-RT-PCR © W. Puppe

33 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR m-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction - Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel - Spezifizierung der Amplifikate im PCR-ELISA © W. Puppe

34 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Einbau von DIG-11-dUTP ( ) in die Amplifikate bei der PCR d-UTP Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 5‘ 3‘ d-UTP GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 GCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-UTP d-UTP Primer 1 ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT d-UTP d-UTP GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 GCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT 3‘ 5‘ d-UTP © W. Puppe

35 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung © W. Puppe

36 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert ) GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

37 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

38 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

39 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) - Zugabe von Substrat GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

40 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) - Zugabe von Substrat Farbentwicklung GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

41 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte) RSV Sonde Ev-Sonde Mp-Sonde InfA-Sonde InfB-Sonde Ad-Sonde Cpn-Sonde PIV3-Sonde PIV1-Sonde Enterovirus M. pneumoniae Influenza A Influenza B Adenovirus C. pneumoniae PIV1 PIV3 RSV neg. Präparation Kontrollen © W. Puppe

42 Nachweis von Erregern mit
UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte & Gel) RSV Sonde Ev-Sonde Mp-Sonde InfA-Sonde InfB-Sonde Ad-Sonde Cpn-Sonde PIV3-Sonde PIV1-Sonde Enterovirus M. pneumoniae Influenza A Influenza B Adenovirus C. pneumoniae PIV1 PIV3 RSV neg. Präparation Kontrollen 2% Agarose 501 404 331 242 190 147 140 bp PIV1 (179) PIV3 (205) RSV (239) Cpn (463) Av (134) InfB (249) InfA (190) Mpn (277) Ev (154) © W. Puppe

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