Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin

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1 Analyse von Makromolekülen mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie in der Molekularen Medizin
Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

2 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Molekulare Medizin Bioanalytik Bioinformatik Genomics Proteomics Transcriptomics DNA Protein RNA Diagnostik Therapie Krankheit Prävention Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

3 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin MALDI-TOF Massenspektrometrie Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Laser + + + Matrix-Biomolekül-Kokristalle Laser Optik Target Time Of Flight Beschleunigungselektrode Detektor + + + Beschleunigungsstrecke Feldfreie Driftstrecke Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

4 Matrizes für die MALDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Matrizes für die MALDI-TOF-MS OH HC C CN COOH a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA): - Peptide bis ca. 5 kDa Pikolinsäure (PA): - DNA - RNA COOH N OH HC C H COOH CH3 H3C O Trans-3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure (Sinapinsäure, SA): - Peptide ab ca. 3 kDa - Proteine 3-Hydroxypikolinsäure (3-HPA): - DNA - RNA COOH N OH 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB): - Proteine - Glykoproteine - Kohlenhydrate OH COOH HO Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

5 Fulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Fulleren-Analyse mit MALDI-TOF-MS monoisotopische Massen  Isotopenauflösung natürliche Isotopenverteilung: C 98,890 % 13C 1,110 % 14N 99,634 % 15N 0,366 % 16O 99,762 % 17O 0,038 % 18O 0,200 % 1H 99,985 % 2H ,015 % „Molekularer Fußball“: Definiertes Regio-Isomer C93H48O12 mit C60-Kern monoisotopische Masse: 1356,3149 Da 1 2 3 4 Rel.Int. rel. int. m/z rel. Int. Rel.Int. Isotopen-Signal Theoretische Verteilung [%] Experimentelle Signal-Höhen [%] Signal-Integrale [%] 94,99 92,81 93,75 1 100,00 2 54,41 55,23 53,12 3 20,34 21,25 20,47 4 5,86 6,94 6,78 Fulleren 1200 1400 1600 1800 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

6 Quantifizierung mit MALDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Quantifizierung mit MALDI-TOF-MS Generelle Aspekte: - Kein direkter Vergleich zwischen einzelnen Signalen aus verschiedenen Spektren - aber: Intraspektraler Vergleich relativer Signal-Höhen- bzw Signal-Integral-Verhältnisse mit internen Standards (direkt aus biologischer Probe oder nach Zugabe) - potentielle Probleme: • Heterogene Verteilung der Biomoleküle im Kristall (“sweet-spots”) • Verunreinigung der Probe (Adduktbildung z.B. mit Na+ oder K+) • Inhomogene Desorptions- und Ionisations-Eigenschaften der Biomoleküle • Definition des Hintergrunds und der Signale - Lösungsansätze: • Summation vieler Laserschüssen an unterschiedliche Positionen zur Mittelung • standardisierte Probenvorbereitung und Präparation des Ko-Kristalls • Mehrfachansätze jeder Einzelprobe (z.B. Triplikate) und statistische Analyse • automatisierte Messung und Auswertung Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

7 Analyse mit MALDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Analyse mit MALDI-TOF-MS Anwendungen: - DNA Level (Genomics): • SNP-Analytik • Mikrosatelliten-Instabilität (MSI) • Verlust der Heterozygotie (LOH) • DNA-Methylierung - RNA Level (Transcriptomics): • Expressions-Analytik - Protein Level (Proteomics): • Protein-Identifizierung • Protein-Modifizierung • Protein-Quantifizierung - Lipid Level (Lipidomics): • Lipid-Komposition Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

8 - Genomics - MALDI-TOF-MS in der DNA-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin - Genomics - MALDI-TOF-MS in der DNA-Analytik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

9 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Der Mensch ? Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

10 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Die Menschen ! Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

11 Ausprägung der Individualität
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Ausprägung der Individualität Gene Individualität Umwelt Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

12 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Risiko Management Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

13 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Risiko Management Risiko Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

14 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Risiko Management CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

15 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Risiko Management CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA Risiko Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

16 Genetische Heterogenität
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Genetische Heterogenität  chromosomale Veränderungen  Insertionen von Nukleotiden  Deletionen von Nukleotiden  Substitutionen von Nukleotiden (single nucleotide polymorphisms) ACGTCGCTGAC TGCAGCGACTG ACGTCAGCTGAC TGCAGTCGACTG ACGTCCTGAC TGCAGGACTG ACGTCACTGAC TGCAGTGACTG Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

17 Single nucleotide polymorphisms
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Single nucleotide polymorphisms  SNP Definition: - SNPs sind Einzelbasensubstitution mit einer Häufigkeit von mindestens 1 % in der betrachteten Population. bei weniger als 1 % Häufigkeit:  Punktmutation  SNP-Frequenzen: - 90% der genetischen Heterogenität bedingt durch SNPs - ca. 1 / 1000 - über 2 Millionen SNPs identifiziert  SNPs in den Genen: - SNPs in regulativen Regionen - ca SNPs in kodierenden Gen-Regionen - kodierende SNPs können zum Aminosäureaustausch führen  SNP Identifizierung: - bioanalytisch: direkte Sequenzierung ... - bioinformatisch: Algorithmen & Datenbanken („Data Mining“) Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

18 Single nucleotide polymorphisms
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Single nucleotide polymorphisms SNPs Positionsmarker Identitätsmarker  Vaterschaft  Forensik  Täter Diagnostik  Kartierung neuer Genorte  Risikoallele  Krankheitsallele  Pharmakogenomik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

19 Methoden zur Genotypisierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Methoden zur Genotypisierung - Messung von sekundären Moleküleigenschaften: z.B. elektrophoretische Mobilität, chromatographisches Verhalten, Hybridisierung: - klassische und Kapillar-Sequenzierung - denaturierende HPLC - Chips Messung einer absoluten, intrinsischen Moleküleigenschaft: Bestimmung der molekularen Masse mit MALDI-TOF Massenspektrometrie Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

20 Molekulare Massen der DNA-Bausteine
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Molekulare Massen der DNA-Bausteine O O - P H N NH2 O O - P H N NH NH2 16 Da 25 Da Desoxyadenosin: 313 Da 9 Da 40 Da Desoxyguanosin: 329 Da D O 24 Da O O - P H N NH2 O O - P H H3C NH 15 Da N O Desoxythymidin: 304 Da Desoxycytosin: Da Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

21 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Das Risiko wiegen ! Gen-Waage Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

22 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin MALDI-TOF Massenspektrometrie Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Laser + + + Matrix-Biomolekül-Kokristalle Laser Optik Target Time Of Flight Beschleunigungselektrode Detektor + + + Beschleunigungsstrecke Feldfreie Driftstrecke Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

23 MALDI-TOF-MS: Probenpräparation
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin MALDI-TOF-MS: Probenpräparation Initiale Probleme bei der MALDI-TOF-MS Analytik : Komplexbildung der DNA mit Ionen (Natrium, Kalium ...) Abnehmende Sensitivität bei größeren Oligonukleotiden - Fragmentierung der DNA Lösungsansätze für die MALDI-TOF-MS Analytik : - Optimierte Reinigung und Probenpräparation - Optimiertes molekulares Design der Testsysteme - Verwendung geeigneter Matrices und Probenträger 7618 7848 Amorphe Silikate Rel. Int. Reversed-Phase Chromatographie Magnetische Partikel 7600 7700 7800 7900 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

24 Blutgerinnungskaskade
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Blutgerinnungskaskade Endogenes System Exogones System Faktor IXa Faktor VIIa Faktor X Faktor Xa Faktor X Faktor Va Prothrombin Thrombin Fibrinogen Fibrin Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

25 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Faktor V Leiden-Allel Normal-Allel Leiden-Allel CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCGAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA CCATGATCAGAGCAGTTCAACCAGGGGAAACCTATACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACCCACAGAAAATGATGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGTGGACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAATAGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGGACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTGAAGTAACCTTTCAGAAATTCTGAGAATTTCTTCTGGCTAGAACATGTTAGGTCTCCTGGCTAAATAATGGGGCATTTCCTTCAAGAGAACA Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

26 Faktor V Leiden-Allel X X Normal-Allel Leiden-Allel
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Faktor V Leiden-Allel Normal-Allel Leiden-Allel Faktor V AKTIVIERUNG „Gas“ Faktor V Thrombin Faktor Va INAKTIVIERUNG „Bremse“ Faktor Va X Protein C Faktor Va inaktiv Faktor Va inaktiv X Stopp der Blutgerinnung Stopp der Blutgerinnung Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

27 Evolution beim Faktor V SNP
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Evolution beim Faktor V SNP  Ethnie-Abhängigkeit: höchste Rate in Europa: G/A ca. 5 % A/A ca. 1: 5000 selten bei Afrikanern und Asiaten  Auftreten ca. vor Jahren nach der Trennung der Kaukasier von Afrikanern und Asiaten  Überlebensvorteil in prä-moderner Zeit: Reduzierte Mortalität bei Geburt und Verletzungen durch erhöhte Blutgerinnung  balancierter Polymorphismus  Und in heutiger Zeit ?  Thromboserisiko ! Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

28 Faktor V Leiden und Thromboserisiko
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Faktor V Leiden und Thromboserisiko  Klinische Ausprägung des Thromboserisikos beeinflußt durch A.) Anzahl der Faktor V Leiden-Allele: - Heterozygotie (G/A): 5 bis 10 -fach erhöhtes Thromboserisiko - Homozygotie (A/A): 80 bis 100 -fach erhöhtes Thromboserisiko B.) Anwesenheit von weiteren genetischen Heterogenitäten: - weitere Risikoerhöhung durch SNP G20210A im Prothrombin-Gen (Faktor II), ca. 3 % Prävalenz in Europa C.) weitere Risikofaktoren: - Alter, Operationen, anhaltende Immobilisierung, Rauchen, orale Kontrazeptiva, Schwangerschaft ... Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

29 Faktor V Leiden Genotypisierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Faktor V Leiden Genotypisierung Faktor V Wildtyp 5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAGAGGAATACAGA-3´ 3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTCTCCTTATGTCT-3´ Faktor V Leiden 5´-AGAGCAGATCCCTGGACAGGAAAGGAATACAGA-3´ 3´-TCTCGTCTAGGGACCTGTCCTTTCCTTATGTCT-3´ Extensionsprimer: CAGATCCCTGGACAGGA Da Reaktion mit dGTP und ddATP: Extensionsprodukt Faktor V Wildtyp CAGATCCCTGGACAGGAGA Da Extensionsprodukt Faktor V Leiden CAGATCCCTGGACAGGAA Da Primer 5181 A-Allel 5478 G-Allel 5807 Probe A Probe B Rel.Int. rel. int. Probe A + 10 % Probe B Probe C Wasserkontolle 5200 5400 5600 5800 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

30 Etablierte SNP Testsystemen
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Etablierte SNP Testsystemen FV: 1 SNP TLR4: 1 SNP FII: SNP TLR2: 1 SNP GLRA1: SNPs ADRB1: 7 SNP PR: SNPs GRIN2B: 2 SNP ACHE: 2 SNPs MYOC: 1 SNP PPP2R3L: 7 SNPs CYP2D6: 1 SNP HFE: 2 SNPs MDR1: 1 SNP MTHFR: 1 SNP TGFBRII: 1 SNP PRNP: 4 SNPs Prnp: SNP APC: 2 SNPs APC: 4 Deletionen HBB: SNPs HBB: 2 Deletionen + 1 Insertion … … Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

31 Genomics und Automatisierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Genomics und Automatisierung Map II Pure Genopure + Puredisk Prä-Analytik Anker-Targets Autoflex Analytik Genotools Post-Analytik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

32 DNA-Reinigung mit magnetischen Beads
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin DNA-Reinigung mit magnetischen Beads “Sass-to-Pure” Map II Pure Puredisk “Mechanik” Zwei-Hand + Multipette 8-Nadel 96-Nadel Probendurchsatz variabel: rel. variabel: fest: 96 Reinigungsleistung sehr gut sehr gut sehr gut Zeitbedarf ca. 90 Minuten ca. 80 Minuten ca. 60 Minuten Zuverlässigkeit prinzipiell hoch hoch hoch Verbrauch-Limitierung Nerven, Sehnen, Muskeln Spitzen Binde- und Waschpuffer Kosten Personal Anschaffung Anschaffung rel. int. rel. int. Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

33 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Anker-Targets Vorteile gegenüber herkömmlichen Targets: Hydrophobe Oberfläche mit hydrophilen Ankern - definierte Positionen für automatische Messung - Mikropräparation mit Makropipetten bzw. Robotik - reduzierte Sweet-Spots - homogenere Präparation - 384 Probenpositionen - erhöhte Sensitivität für Bioanalyte Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

34 Automatische Auswertung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Automatische Auswertung Abnehmende Stringenz der Parameter der automatischen Auswertung Stringenz sehr hoch hoch mittel gering Verlässlichkeit grün hoch gelb mittel rot niedrig grau n.d. rel. int. Genotypen dunkelblau A / A hellblau A / G rot G / G grau n.d. Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

35 Detektion somatischer Mutationen
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Detektion somatischer Mutationen Mikrosatelliten-Instabilität: • Verlust oder Einfügen repetitiver Einheiten in Mikrosatelliten • Verursacht durch DNA-Polymerase Slippage und Defekte im MMR-System • Schlüsselrolle in Genese und Progression von Tumoren • Assoziation mit heriditärem nicht polypösem Kolonkarzinom (HNPCC) und in ca. 15 % aller sporadischen Tumore detektiert • Detektion bisher über Gel-basierte Methoden (Bandenverschiebung) • Bioinformatische Identifizierung von kodierenden Mikrosatelliten (> 17000/Genom) Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

36 Interne Quantifizierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Interne Quantifizierung Bestimmung der intern Signal-Integral Verhältnisse mit MALDI-TOF-MS 1.) Messung verschiedener molarer Verhältnisse zweier synthetischer Oligonukleotide: 2.) Bestimmung der Signal-Integral-Verhältnisse Beispiel: Mikrosatellit im GART-Gen (Phosphoribosylglycinamid Formyltransferase-Gen) Extensionsprodukte: Mikrosatellit GART: Wt = 10 T AGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTTC Mikrosatellit GART: -1 Deletion = T AGCCACTCTGGCCTTTTTTTTTC Signal-Integral Verhältnisse (-1 Deletion / Wt) 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1,0 Molare Verhältnisse (-1 Deletion / Wt) Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

37 Mikrosatelliten-Instabilität: GART
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Mikrosatelliten-Instabilität: GART GART Wildtyp 5´-TTTGAAAAAAAAAAGGCCAGAGTGGCTGTCTTA-3´ 3´-AAACTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGACAGAAT-3´ Extensionsprimer: TTTTTTTCCGGTCTCACCGA Da Reaktion mit dTTP und ddCTP: Extensionsprodukt GART Wildtyp CTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA Da Extensionsprodukt GART -1 Deletion CTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA Da Extensionsprodukt GART +1 Insertion CTTTTTTTTTTTCCGGTCTCACCGA Da Primer 6026 -1 Del 6907 Wt 7211 +1 Ins 7515 Kontrolle Patient 184 Kontrollgewebe ! Patient 184 Tumorgewebe Rel.Int. Patient 218 Kontrollgewebe rel. int. ! Patient 218 Tumorgewebe ! Zell-Linie KM12 6300 6800 7300 m/z ! = MSI Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

38 Etablierte MSI Testsysteme
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Etablierte MSI Testsysteme GART: A10 – Mikrosatellit Chromosom 21q22.1 AC1: T10 - Mikrosatellit Chromosom 4p16 TGFBRII: A10 - Mikrosatellit Chromosom 3p22 MSH3: A Mikrosatellit Chromosom 5q11-q12 MSH6: C Mikrosatellit Chromosom 2p16 Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

39 Verlust der Heterozygotie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Verlust der Heterozygotie Zwei-Hit Modell der Tumorigenese: 1.) Keimbahn-Mutataion  Heterozygotie 2.) Somatische Mutation  Verlust der Heterozygotie (loss of heterozygosity, LOH)  wichtig für Tumorsuppressor-Gene  Verlust der Funktion (loss of function) Detektion von LOH mit MALDI-TOF-MS: - DNA Extraktion und PCR - Primerextensionsreaktion und MALDI-TOF-MS - relative Signalverhältnisse  Vergleich von relativen Signalverhältnissen: Tumor- versus Kontrollgewebe TS-Gen (functional) TS-Gen (dysfunctional) 1. Hit 2. Hit Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

40 Verlust der Heterozygotie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Verlust der Heterozygotie LOH-Analyse mit MALDI-TOF-MS Potentielles Tumorsuppressor-Gen PPP2R3B: T/C SNP an Nukleotidposition  Verlust des T-Allels bei Brustkrebs Extension: dTTP, ddATP und ddCTP Primer TGAAGCGCTGCAAGCTGGC Da C-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCC Da T-Allel TGAAGCGCTGCAAGCTGGCTA Da Patient Gewebe Signal Integral Verhältnis (T/C) Höhen A Kontrolle 1.01 1.03 Tumor 0.28 0.26 B 0.98 0.96 0.15 0.14 C 0.95 0.93 0.92 0.91 Rel.Int. 6100 6500 6300 5900 5855 6128 6456 C-Allel T-Allel Primer m/z Patient A: Kontrollgewebe Patient A: Tumorgewebe Patient B: Kontrollgewebe Patient B: Tumorgewebe ! ! = LOH Patient C: Kontrollgewebe Patient C: Tumorgewebe Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

41 Verlust der Heterozygotie
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Verlust der Heterozygotie 1.2 PPP2R3B: SNP T/C kein LOH LOH ! 1.0 0.8 Signal Verhältnis (T /C) Kontrolgewebe 0.6 Tumorgewebe 0.4 n=4 0.2 0.0 A B C D Patient Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

42 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
DNA-Methylierung Bedeutung der DNA-Methylierung: Prokaryonten: • Abwehrreaktion gegen Bakteriophagen in Kombination mit Restriktionsendonukleasen • Timing der DNA-Replikation und DNA-Reparatur • Regulation der Gen-Expression Eukaryonten: • Repression der Gen-Expression: • Entwicklungskontrolle, genomisches Imprinting, X-chromosomale Inaktivierung Herkömmliche Techniken zur Analyse der in vitro-DNA-Methylierung: • Einsatz radioaktiver Methylierungsreagenzien • Protektion der Restriktionsendonuklease-Reaktion Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

43 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
DNA-Methylierung DNA-Methylierung erfolgt durch die Methyltransferasen (MTasen). S-Adenosylmethionin (SAM) als Donor von aktivierten Methylgruppen. Beispiel: E. coli dam MTase erkennt Palindrom GATC: 5´-GCCCGGGGATCCGGCCGCG–3´ Da 3´-CGGGCCCCTAGGCCGGCGC-(T)6-Biotin 7672 Da CH3 Methylierung führt zu einem definierten Anstieg der molekularen Masse des Oligonukleotids von 14 Da.  Analyse mit MALDI-TOF-MS 5793 7672 5793 5807 0 Min 1 Min 2 Min rel. int. 5 Min rel. Int. 10 Min 20 Min 40 Min 60 Min 6000 7000 m/z 5750 5850 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

44 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
DNA-Methylierung Genomische DNA-Methylierung geht bei PCR verloren.  keine direkte Analyse mit MALDI-TOF-MS möglich! Chemische Reaktion mit Natrium-Bisulfit: • unmethyliertes Cytosin  Uracil (hydrolytische Deaminierung) • methyliertes Cytosin resistent gegen Modifikation Nach Bisulfit-Behandlung und PCR: • PCR-Fragmente mit T statt unmethyliertes C • PCR-Fragmente mit C statt methyliertes C  Virtueller C/T-SNP, der den positionsspezifischen Methylierungsstaus wiederspiegelt  Primerextension und MALDI-TOF-MS Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

45 - Transcriptomics - MALDI-TOF-MS in der RNA-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin - Transcriptomics - MALDI-TOF-MS in der RNA-Analytik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

46 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Expressions-Analyse Gewebepräparation Extension Extension A B C D Primer Produkt Primer Product RNA Präparation Ziel-Gen Ziel-Gen Haushalts Gen Haushalts Gen RT-PCR Ziel-Gen Haushalts-Gen Steigende Mengen der Ziel-Gen mRNA Ko-Reinigung Rel.Int. Primerextension Ko-Reinigung MALDI-TOF-MS Signal-Verhältnisse Quantifizierung m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

47 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Expressions-Analyse Ziel-Gene • Glycin Rezeptor b-Untereinheit (glrb) • GABA-A Rezeptor a2-Untereinheit (a2) • GABA-A Rezeptor -Untereinheit () Haushalts-Gene • b-Aktin • Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl Transferase (HPRT) Analyse-Level • murines Modell (Gewebe) • klonierte Fragmente (Plasmide) • synthetische Templat-Oligonukleotide Kontrollansätze • TaqMan • Light Cycler Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

48 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Expressions-Analyse glrb GACTATAGAGTTAACATTTTCTTGAGACAGAAATGGAATGACCCCAGACTCAAGCTACCTAGTGACTTCAGAGGCTCAGATGCACTGACAGTTGACCCCACCATGTATAAGTGCTTGTGGAAACCTGACTTATTCTTTGCAAATGAAAAAAGTGCCAATTTTCATGATGTGACCCAAGAAAATATCCTGTTGTTTATCTTTCGGGATGGAGACGTCCTTGTGAGC Extension: ddGTP Primer: ACAGTTGACCCCACCAT 5100 Da A Produkt ACAGTTGACCCCACCATG Da B b-Aktin TGAGACCTTCAACACCCCAGCCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTATGCCTCTGGTCGTACCACAGGCATTGTGATGGACTCCGGAGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACGAGGGCTATGCTCTCCCTCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCC Primer: TCCCTGTATGCCTCTGGTC 5723 Da C Produkt: TCCCTGTATGCCTCTGGTCG Da D A B C D 5100 5413 5723 6036 Cortex von unterschiedlichen Mäusen (B/A) (D/C) C57/BL6+/+ 7.0 C3H/HeJ+/+ 5.4 Rel.Int. C57/BL6s/s 0.7 B6/C3Hs/s 2.1 5200 5400 5600 5800 6000 m/z (B/A) = Verhältnis des glrb-Produkts (Ziel-Gen) (D/C) = Verhältnis des b-Aktin-Produkts (haushalts-Gen) (B/A) / (D/C) = relative Mengen des Ziel-GenTranskritps Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

49 - Proteomics - MALDI-TOF-MS in der Protein-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin - Proteomics - MALDI-TOF-MS in der Protein-Analytik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

50 Die Bausteine der Proteine
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Die Bausteine der Proteine Monoisotopische molekulare Massen von Aminosäuren (-H20) [Da] : Gly (G) 57,0215 Asp (D) 115,0269 Ala (A) 71, Gln (Q) 128,0586 Ser (S) 87, Lys (K) 128,0950 Pro (P) 97, Glu (E) 129,0426 Val (V) , Met (M) 131,0405 Thr (T) 101, His (H) 137,0589 Cys (C) Phe (P) 147,0684 Leu (L) 114, Arg (R) 156,1011 Ile (I) 114, Tyr (Y) 163,0633 Asn (N) 115, Trp (W) 186,0793 Dm = 0,0364 isobar Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

51 Modifizierungen der Proteine
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Modifizierungen der Proteine Veränderungen der monoisotopische molekularen Massen [Da]: Met  Homoserin (CNBr-Abbau) ,9928 Glykosylierung (N-Acextylglucosamin) ,0794 Gln  Pyroglutaminsäure ,0265 Liponsäure ( NH-Lys) + 188,0330 Bildung von Disulfidbrücken ,0157 Farnesylierung + 204,1878 C-terminale Amidbildung ,9840 Myristoylierung + 210,1984 Methylester ,0157 Biotinylierung ,0776 Hydroxylierung / Met-Oxidation ,9959 Addition Pyridoxalphosphat + 231,0297 Formylierung ,9949 Palmitoylierung + 238,2297 Acetylierung ,0106 Steaorylierung + 266,2610 Carboxylierung ,9898 Geranylgeranylierung + 272,2504 Phosphorylierung ,9663 Addition N-Acetylneuraminsäure + 291,0954 Sulfatierung ,9568 Addition Glutathion + 305,0682 Glykosylierung (Pentose) ,0423 Adenosylierung + 329,0525 Glykosylierung (Hexosamin) + 161,0688 Addition Phosphopantethein + 339,0780 Glykosylierung (Hexose) + 162,0528 ADP-Ribosylierung + 541,0611 Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

52 Protein Leitersequenzierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Protein Leitersequenzierung Spaltungen mit Carboxypeptidasen  Detektion verkürzter Peptide mit MALDI-TOF-MS  Massendifferenzen liefern Seqeunzinformation - Vorteile: - C-terminale Sequenzinformation - repetitive Sequenzen analysierbar - Detektion von Modifizierungen - Nachteile : - relativ kurze “sequence tags” - Leucine und Isoleucin: isobar Beispiel: b-Amyloid Peptide 1100 1500 m/z 1900 G Y E V H Q K L/I rel. int. rel. int. Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

53 Post Source Decay (PSD)
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Post Source Decay (PSD) Fragmentierung metastabiler Analyten in feldfreier Driftstrecke nach der Beschleunigung: Pm+  F+ + Fn Fragmentierung metastabiler Peptide meistens im Proteinrückgrat: N-term. Ladung: a-, b-, c- Serien C-term. Ladung: x-, y-, z- Serien Example: Adrenocorticotrope Hormone (ACTH) rel. int. rel. int. adapted from “Bioanaltyik”, F.Lottspeich and H. Zorbas Spektrum Verlag (1998) Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

54 Massen-Finger-Prints
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Massen-Finger-Prints MALDI-TOF-MS Datenbanksuche mit Massen-Finger-Prints 2D-Gel-Elektrophorese b -Actin Rel. Int. In-Gel-Verdau einzelner Spots CyclophillinA Rel. Int. no match Rel. Int. Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

55 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
NR2B im neonatalen Herz NR2B: RT-PCR-Analyse im neonatalen Rattenherz: NMDA-Rezeptor: - Excitatorischer Neurotransmitter-Rezeptor Ligand: Glutamat Ionenkanal  Permeabilität für Na+ und Ca2+ - Hetero-Tetramer aus einer oligatorischer NR1- und variablen NR2 a-d -Untereinheiten - klassische Lokalisation: Nervensystem Cx Herz E 1 8 NR2B H O 2 a d u l t P 5 b -Aktin M Primer 1380 635 517 1125 NR2B: Westernblot-Analyse im neonatalen Rattenherz: Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

56 NR2B: Molekularer Interaktionspartner
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin NR2B: Molekularer Interaktionspartner Immunpräzipitation von Membranfraktionen mit Anti-NR2B-Antikörper  SDS-PAGE  Proteinfärbung Immunpräzipitation und Westernblot-Analyse: ? A B Sol IP Sol IP kD NR2B ? Ryanodin- Rezeptor kD 205 IP-Rezeptor 3 205 Konfokale Laserscan-Mikroskopie: In-Gel-Verdau  MALDI-TOF-MS  Massenfingerprints Datenbank- suche BSA NR2B Ryanodin Rezeptor BSA-Kontrolle 180 kD-Protein NR2B Ryanodin-R Überlagerung molekularer Interaktionspartner der NR2B-Untereinheit im neonatalen Rattenherz  Ryanodin-Rezeptor >205 kD-Protein 1 2 3 4 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

57 Modifikationen von b-Thymosinen
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Modifikationen von b-Thymosinen ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES - Substrate für Transglutaminasen Reaction mit Aminogruppen - 3 Glutaminreste (Q) an Positionen 23, 36 und 39: - b-Thymosine: Familile von 5 kDa Peptiden - Funktion: intrazellulär: Sequestrierung von G-Aktin  Regulation des Cytoskeletts extrazellulär: Blutgerinnung und Wundheilung m/z Rel.Int. ohne Modifikation einfache Modifikation doppelte Modifikation 5000 6000 - Peptid Mapping: nur Glutamine 23 und 36 modifiziert (Reaktivität, Vergänglichkeit) - Detektion intramolekulare Isopeptidbindungen zwischen spezifischen Lysinen und Gluatminen in vitro und in vivo Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

58 Glykierung von Proteinen
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Glykierung von Proteinen Bei der nicht-enzymatischen Glykierung werden im Unterschied zur enzymatischen Glykosylierung die Aminosäureseitenketten von Lysin und Arginin modifiziert ! 1.) Reaktion von reduzierenden Zuckern (z. B. Glucose) mit Aminogruppen eines Proteins unter Ausbildung von Schiff‘schen Basen (reversibel) 2.) Amadori-Umlagerung (reversibel) 3.) Nachgeschaltete Abbaureaktionen führen zu „Advanced Glycation Endproducts“ (irreversibel) Bedeutung: - Medizin: Diabetes mellitus mit diversen Folgeschäden z.B. Retinopathie, renale Dysfunktion - Lebensmittelchemie: Bräunungsreaktionen (Maillard-Reaktion) Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

59 Advanced Glycation Endproducts
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Advanced Glycation Endproducts Lysin spezifische Produkte Arginin spezifische Produkte Dm 58 Da Dm 144 Da Carboxymethyl-Lysin (CML) Imidazolon A Dm 72 Da Dm 54 Da Carboxyethyl-Lysin (CEL) Methylimidazolon Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

60 Glykierung intakter Proteine
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Glykierung intakter Proteine 14313 natives Lysozym CML-Lysozym Rel.Int. rel. int. CEL-Lysozym 3-Desoxyglucoson-Lysozym Methylglyoxal-Lysozym glykiertes Lysozym 13000 15000 17000 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

61 Glykierung und Peptide
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Glykierung und Peptide Lysozym AGE-Lysozym Glukose Glu-C-Spaltung MALDI-TOF-MS Amadori CML Imidazolon 838 1000 896 838 896 1000 1202 rel. int. 1346 1202 1346 K V F G R C E K V F G R C E K V F G R C E V Q A W I R G C R L V Q A W I R G C R L N H N H N H N H N H 2 C H C H 2 2 H N N H N N H O 2 O O H H O H O C 4 O 3 H 9 H O H H O H m/z m/z C H O H 2 Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

62 Quantifizierung der Glykierung
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Quantifizierung der Glykierung m/z 850 900 950 1000 838 896 CML Amadori Rel.Int. ohne Glukose 1 Woche Glukose 4 Woche Glukose 8 Woche Glukose 16 Woche Glukose unmodifiziert CML Amadori 90 80 70 60 50 % des totalen Integrals 40 rel. int. rel. int. 30 rel. Int. 20 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Inkubationsdauer [Wochen] Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

63 Molekulare Heterogenität: Poly-L-Lysin
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Molekulare Heterogenität: Poly-L-Lysin Rel.Int. rel. int. rel. Int. Poly-L-Lysin 2000 4000 6000 8000 10000 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

64 Zusammenfassung Proteinanalytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Zusammenfassung Proteinanalytik Biologisches Material 2D-Gel- Elektrophorese Protein-Reinigung Crosslink In-Gel-Verdau Protein-Verdau Exoproteasen MALDI - TOF Massenspektrometrie Massen-Finger-Print Peptid-Leiter Datenbanken Identifizierung bekannter Proteine Detektion unbekannter Proteine Analyse von Protein- Modifizierungen Analyse von 3o- und 4o-Strukturen Sequenz- Information (1o-Struktur) Masse des intakten Proteins Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

65 Protein Separation & Clinical Proteomics
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Protein Separation & Clinical Proteomics ProteinChips Magnetische Beads Chemische Oberflächen – Protein Expressions Profiling: Bead Suspension Bindung: Waschen: Beads Hydrophob Anionisch Kationisch IMAC Normael Phase Biologische Oberflächen – Protein Interaktions Assays: Serum Waschen und Sammeln: Elution: MALDI-Probenpräparation: Puffer Matrix MALDITarget aktivierte Oberflächen AK-AG Rezeptor - Ligand DNA - Protein Eluat (adapted from Ciphergen) (adapted from Villanueva et al. 2004) SELDI-TOF-MS MALDI-TOF-MS Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

66 ProteinChips und SELDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin ProteinChips und SELDI-TOF-MS Biomarker Profiling: 1.) ProteinChip: Ionenaustausch Chromatographie 2 biologische Proben (A und B): pH 10, 8, 6 und 4 2.) SELDI-TOF-MS Analyse: pH Probe A B A B A B A B 7000 7250 7500 …ISEVXXDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA…   peptide peptide Analysis von b Amyloid Varianten: NTA4 mAb  peptide 20 40 2000 3000 4000 5000 4514.4 Peptid Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

67 ProteinChips und SELDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin ProteinChips und SELDI-TOF-MS Analyse von Schweiss ProteinChips und SELDI-TOF-MS Dermcidin Insulin Flad et al. 2002 Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

68 MALDI-TOF-MS & Clinical Proteomics
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin MALDI-TOF-MS & Clinical Proteomics Vergleich von chromatografischen Beads Mischung von 7 Peptiden (1 kDa - 3 kDa) Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX) - MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA Vergleich von chromatografischen Beads menschliches Serum Chromatographie auf magn. Beads (HIC, IMAC, WAX, WCX) - MALDI-TOF-MS Analyse (linearer Modus), Matrix HCCA Somatostatin 28 Angiotensin II Angiotensin I Substance P ACTH (1-17) ACTH (18-39) Bombesin HIC Rel.Int. Rel.Int. HIC IMAC IMAC WAX WAX WCX WCX 1400 2400 3400 m/z 2000 4000 6000 8000 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

69 MALDI-TOF-MS & Clinical Proteomics
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin MALDI-TOF-MS & Clinical Proteomics Zellkulturüberstand Gift einer Taiwanesischen Giftschlange (banded krait Bungarus multicinctus): Beta-Bungarotoxin (BBTx) BBTx induziert neuronale Apoptose (hippocampale Kulturen): - Bindung an spannungsabhängige K+ Kanäle - Internalisierung - Anstieg von intrazellulärem Ca2+ - Anstieg reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) - Modifizierung von Proteinen und Lipiden - Apoptose Zellkulturüberstand m/z Kontrolle 24h BBTx 2000 2500 3000 Rel.Int. Zellkulturüberstand m/z Kontrolle 24h BBTx 2000 4000 6000 8000 Rel.Int. Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

70 - Lipidomics - MALDI-TOF-MS in der Lipid-Analytik
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin - Lipidomics - MALDI-TOF-MS in der Lipid-Analytik Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

71 Lipid-Analyse mit MALDI-TOF-MS
Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin Lipid-Analyse mit MALDI-TOF-MS A B C Signalbereiche A 1 2 3 4 5 1 PC 16:0 / 18:2 oder PC 16:1 / 18:1 oder PC 16:2 / 18:0 3 PC 16:0 / 18:1 oder PC 16:1 / 18:0 5 PC 16:0 / 18:0 Rel.Int. rel. int. 760 m/z B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1-5 Na+ -Shifts von A1-A5 ? 3 PC 16:0 / 20:4 6 PC 18:0 / 18:2 oder ... PC 18:1 / 18:1 8 PC 18:0 / 18:1 Rel.Int. Rel.Int. 780 790 m/z C 1 2 3 4 5 6 1 PC 16:0 / 22:6 oder ... 3-6 Na+ -Shifts von B6-B9 ? 3 PC 18:1 / 20:4 oder ... 5 PC 18:0 / 20:4 oder ... Phosphatidyl- cholin rel. int. Rel.Int. 750 770 790 810 m/z 810 m/z Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

72 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Genauigkeit Geschwindigkeit Quantifizierung Auflösung MALDI TOF MS Automatisierung Sensitivität Hochdurchsatz Kosteneffizienz Reproduzierbarkeit Poolen & Multiplex Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg

73 Analyse von Makromolekülen mit MALDI-TOF-MS in der Molekularen Medizin
Danksagung Institut für Biochemie (Universität Erlangen-Nürnberg) Cord-Michael Becker Kristina Becker Katrin Schiebel Silke Seeber Daniela Gockenhammer Andre Reuland Thomas Bonk Julia Brill Nadine Balbus Claudia Sass Thomas Kislinger Klinik für Frauenheilkunde (Universität Erlangen-Nürnberg) Mattias Beckmann Reiner Strick Pamela Strissel Ludwig Wildt Alexander Berkholz Michael Bauer Insitut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (Universität Erlangen-Nürnberg) Monika Pischetsrieder Carlo Peich Jasmin Meltretter Molekulare Diagnostik (Universität Heidelberg) Magnus von Knebel-Döberitz Johannes Gebbert Christian Sutter Bruker Daltonik GmbH (Bremen und Leipzig) Jochen Franzen Uwe Rapp Markus Kostrzewa Andreas Humeny Lehrstuhl für Biochemie und Molekulare Medizin Institut für Biochemie Emil-Fischer-Zentrum Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg