CRISPR/Cas9 Gentechnik

Präsentation zum Thema: "CRISPR/Cas9 Gentechnik"—  Präsentation transkript:

1 CRISPR/Cas9 Gentechnik
Gezieltes einbringen in MO, Knock out, Golden (carotin), Somatischen gentherapie Insertion Deletion Virenbasierte systeme (homologe rekombination – 1000 bp) CRISPR Cas … Schutz Bakterien vor Virusangriffen Gentechnik

2 Integration großer DNA-Fragmente in E.coli mittels CRISPR/Cas9
Crispr cas für DSB  system für homologe rekombination benötigt  lambda red Sarah Haenelt

3 λ-Red – Anwendung in der Gentechnik
Donor-DNA Gam ApR pλRed (pKD46) Gam Beta Exo Exo Beta Lambda red bacteriophage Exo… Beta… schützt ssDNA und erleichtert anlagerung Gam… verdau donor dna durch nukleasen target-DNA Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

4 CRISPR/Cas9 – ein effektives System zum Schutz vor Viren
tracr-RNA CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein CRISPR/Cas9-Komplex crRNA pCRISPR ᶲ KmR Cm…Chloramphenicol CRISPR-RNA Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

5 CRISPR/Cas9 – ein effektives System zum Schutz vor Viren
target DNA Doppelstrangbruch CRISPR/Cas9-Komplex Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

6 Induktion von Doppelstrangbrüchen in E.coli MG1655
Lac Z Lac Z tracr-RNA tracr-RNA KmR CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein KmR pCRISPR lacZ pCRISPR ∆crRNA CRISPR-RNA mit LacZ-Seq. Lac Z crRNA (lacZ-Seq.) tracr-RNA CmR pCas9 tracrRNA cas9 Cas9-Protein KmR pCRISPR ᶲ CRISPR-RNA ohne LacZ-Seq. crRNA Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

7 Die SOS-Antwort der Zelle
Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ recA umuDC Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ recA Lac Z CmR pCas9 tracrRNA cas9 crRNA (LacZ) KmR pCRISPR LacZ umuDC WT ∆umuDC ∆recA umuDC … DNA-Pol V Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

8 Homologe Rekombination im E.coli MG1655 Wiltyp
recA Lac Z HRL HRR Lac Z HRL HRR pCas9 pCRISPR LacZ pλRed HRL HRR TcR CRISPR/Cas9-System Wildtyp pλRed Lac Z HRL HRR recA TcR HRL … homologer Arm links HRR … homologer Arm rechts Je ca. 50 bp lang λ-Red-Kontrolle Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

9 Homologe Rekombination in der E.coli ∆recA-Mutante
pCas9 pCRISPR LacZ pλRed Lac Z HRL HRR TcR CRISPR/Cas9-System ∆recA-Mutante recA Kontrolle λ-Red pλRed Lac Z HRL HRR TcR λ-Red-Kontrolle Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

10 Homologe Rekombination großer DNA-Abschnitte
TcR HRL HRR 1.4 kb TcR TcR HRL HRL HRR 2.4 kb Spacer Spacer TcR HRL HRR 3.9 kb Spacer TcR HRL HRR 5.4 kb Spacer TcR HRL HRR 7.0 kb Spacer HRL … homologer Arm links HRR … homologer Arm rechts Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

11 Homologe Rekombination in anderen E.coli-Stämmen
E. coli BL21 (DE3) E. coli W Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

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Zusammenfassung CRISPR/Cas9 ist ein effektives System zur Induktion von Doppelstrangbrüchen CRISPR/Cas9 ermöglicht Einbau von Sequenzen bis zu einer Länge von 7 kb in das E.coli-Genom (Rekombinationseffizienz von 61 %) Das Ausschalten des recA-Gens erhöht die Effizienz des Einbaus Die Rekombinationseffizienz unterscheidet sich deutlich zwischen unterschiedlichen E.coli-Stämmen Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

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Literatur Chung Mu-En, Yeh I-Hsin, Sung Li-Yu, et al. (2017): Enhanced Integration of Large DNA Into E. coli Chromosome by CRISPR/Cas9. Biotechnology and Bioengineering, 114 (1), S Anthony R. Poteete (2001): What makes the bacteriophage λ Red system useful for genetic engineering: molecular mechanism and biological function. FEMS Microbiology Letters, 201 (1), S.9-14 Le Cong, Ann Ran F., Cox David, et al. (2013): Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science, 339 (6121), S Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie

14 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!
Noch Fragen? Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! Sarah Haenelt, Seminar Biotechnologie