Notwendigkeit von Tierversuchen in der biomedizinischen Forschung verstehen Notwendigkeit von Tierversuchen in der biomedizinischen Forschung Beispiel: Krebsforschung Prof. Dr. M. Lohoff

Warum Tierversuche? Tiere werden eingesetzt, wenn man wissen muss, was in einem gesamten, lebenden Körper passiert, der viel komplexer ist, als die Summe seiner einzelnen Teile. Es ist manchmal unmöglich, die Verwendung von lebenden Tieren in der Forschung durch alternative Methoden komplett zu ersetzen. In-vitro-Verfahren und Computermodelle spielen eine wichtige Rolle zur Ergänzung von Daten aus Tiermodellen. Tierexperimente sind Voraussetzung für entscheidende Fortschritte in der Therapie von Krankheiten. Tierversuche haben eine wichtige Rolle bei fast allen medizinischen Durchbrüchen im letzten Jahrzehnt gespielt. Tierexperimente sind entscheidend, um den späteren Erfolg beim Menschen vorauszusagen. Wir teilen 99% unserer Gene mit einer Maus, daher sind sie ein effektives Modell für den menschlichen Körper. Deutschland gehört weltweit zu den Ländern mit den höchsten Standards im Bereich Tierschutz. Tierversuche dürfen nur nach Genehmigung durchgeführt werden. Tierversuche sind auf ein notwendiges Minimum zu beschränken. Richtlinie „Drei Rs“ (reduction, refinement and replacement“ ( Reduktion, Verfeinerung und Ersatz). Zu 5: DFG, Tierversuche in der Forschung, 2004, pp 18: Durch Tierversuche lassen sich erwünschte und etwa 70% der unerwünschten Wirkungen, die den Menschen betreffen, vorhersagen. Ohne Tierversuche gäbe es mehr Fälle wie 01/2015 in Frankreich. Es ist nicht möglich eine 100-prozentige Vorhersage zu treffen, mit keiner Methode. Wir teilen 99% unserer Gene mit einer Maus, daher sind sie ein effektives Modell für den menschlichen Körper. Quelle: Nature. 2002, Vol 420: http://www.nature.com/nature/journal/v420/n6915/pdf/420509a.pdf

Beitrag von Tierversuchen zur Etablierung einer Therapie gegen schwarzen Hautkrebs In der Folge nun eine Serie bahnbrechender Forschungserfolge (gezeigt an Hand der jeweiligen Veröffentlichung), die mittlerweile eine Behandlung für diesen Tumor ermöglichen. Weiter wird gezeigt, welchen Anteil daran Mausversuche hatten.

Schwarzer Hautkrebs (malignes Melanom) hochgradig bösartiger Tumor der Pigmentzellen streut früh Metastasen am häufigsten tödlich verlaufende Hautkrankheit weltweit stark steigende Anzahl an Neuerkrankungen Epidermis Dermis Subcutaneous tissue

2001: Prognosefaktoren beim schwarzer Hautkrebs X 2001- keine effektive Therapiemöglichkeit 20-40% der Patienten sterben innerhalb von 6 Monaten X 40-60% der Patienten sterben innerhalb von 1 Jahr Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634

Wie haben Mausexperimente geholfen eine effektivere Therapie zu etablieren?

PD-1

1992: Identifizierung und Charakterisierung des Gens für das Protein PD-1 in Mauszelllinien Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895 1994: Identifizierung des Gens für menschliches PD-1 unter Zuhilfenahme der Information von Maus PD-1 Abstract To determine the structure and chromosomal location of the human PD-1 gene, we screened a human T cell cDNA library by mouse PD-1 probe and isolated a cDNA coding for the human PD1-protein. Zusammenfassung Um die Struktur und die chromosomale Lage des menschlichen PD-1-Gens zu bestimmen, wurde eine humane T-Zell-cDNA -Bibliothek mit der Maus PD-1–Sonde durchsucht und eine cDNA, die für das humane PD1-Protein kodiert, isoliert. Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706

Zudem wurde erforscht: Signal Immunzelle PD-1 PD-1 Partnermolekül Im Weiteren: PD-1 sitzt auf der Zelloberfläche mancher Immunzellen Es gibt ein Partnermolekül. Wenn dieses bindet, entsteht ein Signal in der Zelle mit PD-1 vereinfachte Darstellung

Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. 1999: Herstellung einer Maus ohne PD-1 Gen und daher ohne PD-1 Eiweiß Eine Maus ohne PD-1 entwickelt Autoimmun-Erkrankungen (dabei greift das Immunsystem den eigenen Körper an) Fazit: PD-1 hat eine hemmende Funktion im Immunsystem Immun- zelle PD-1 PD-1 Partnermolekül hemmendes Signal vereinfachte Darstellung Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. Nur dieses Mausmodell konnte die Entdeckung ermöglichen. Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151

2004: Antikörper, welche die Funktion von PD-1 hemmen, reduzieren die Metastasierung des Melanoms in Mäusen Lebermetastasen Behandlung mit: Kontroll- Antikörper Antikörper gegen PD-1 Ergebnis: weniger Lebermetastasen Mäuse die mit Antikörpern gegen PD-1 behandelt werden besitzen weniger und kleinere Lebermetastasen. Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144

X Besondere Immunzellen zur Abwehr von Tumoren und Viren sind T-Zellen Erkennung von Fremdmaterial (=Antigen) durch einen hochspezifischen Rezeptor. Abtötung der erkannten Zelle. X T-Zelle T-Zell-Rezeptor Tumor-Zelle / virusinfizierte Zelle Antigen Tötungssignal vereinfachte Darstellung

Das Tötungssignal wird verhindert. 2006: Entdeckung einer T-Zell-Population mit PD-1 auf ihrer Oberfläche bei einer chronischen Virusinfektion in Mäusen Das Tötungssignal wird verhindert. T-Zell-Rezeptor Virus-Teil (=Antigen) Tumor-Zelle / virusinfizierte Zelle ausgebremste T-Zelle hemmt PD1-Partnermolekül PD-1 vereinfachte Darstellung Hypothese: PD-1 hemmt die T-Lymphozyten Idee: Erneut Einsatz eines Antikörpers gegen PD-1 in Mäusen, zur Verhinderung der Bindung von PD-1 an sein Partnermolekül. Frage: Wird die Hemmung nun beeinflusst? Wird „enthemmt“ und werden die T-Lymphozyten wieder aktiv? Erfolgreiche Therapie der chronischen Virusinfektion? Antwort: Genau so. Die chronische Infektion wird geheilt. Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

2006: Entdeckung einer T-Zell-Population mit PD-1 auf ihrer Oberfläche bei einer chronischen Virusinfektion in Mäusen Aber diese Hemmung kann durch einen Antikörper gegen PD-1 aufgehoben werden. X Die chronische Infektion wird geheilt! Tötungssignal Virusinfizierte Zelle T-Zelle Neustart! Neustart? PD-1 PD1-Partnermolekül Antikörper gegen PD-1 eliminieren das Hemmsignal Hypothese: PD-1 hemmt die T-Lymphozyten Idee: Erneut Einsatz eines Antikörpers gegen PD-1 in Mäusen, zur Verhinderung der Bindung von PD-1 an sein Partnermolekül. Frage: Wird die Hemmung nun beeinflusst? Wird „enthemmt“ und werden die T-Lymphozyten wieder aktiv? Erfolgreiche Therapie der chronischen Virusinfektion? Antwort: Genau so. Die chronische Infektion wird geheilt. vereinfachte Darstellung Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687

Klar messbare, aber eingeschränkte therapeutische Wirksamkeit 2012: Erste Anwendung von Antikörpern gegen PD-1 beim menschlichen Melanom Klar messbare, aber eingeschränkte therapeutische Wirksamkeit 28% der Patienten reagieren Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454

CTLA-4 Im Folgenden eine ähnliche Geschichte für ein anderes hemmendes Molekül: CTLA-4.

1987: Identifizierung des Gens für Maus CTLA-4 Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270 1988: Identifizierung des Gens für Human CTLA-4 Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905 unter Zuhilfenahme der Information von Maus CTLA-4 Abstract Whereas the overall homology between the human and murine CTLA-4 proteins is 76%, there is, remarkably, a complete identity of their cytoplasmic domains. This complete interspecies conservation comes in support of an important role for this domain in CTLA-4 function. Zusammenfassung Während die Gesamthomologie zwischen den menschlichen und murinen CTLA-4 Proteinen 76% beträgt, sind die cytoplasmatischen Domänen, be-merkenswerterweise, komplett identisch. Diese vollkommene artenübergreifende Konservierung weist auf eine wichtige Rolle dieser Domäne in der CTLA-4 Funktion hin.

Zudem wurde erforscht: Signal Immunzelle CTLA-4 CTLA-4 Partnermolekül Im Weiteren: CTLA-4 sitzt auf der Zelloberfläche mancher Immunzellen Es gibt ein Partnermolekül. Wenn dieses bindet, entsteht ein Signal in der Zelle mit CTLA-4 vereinfachte Darstellung

Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. 1995: Herstellung einer CTLA-4 Gen-defizienten Maus Eine Maus ohne CTLA-4 entwickelt Autoimmun-Erkrankungen (dabei greift das Immunsystem den eigenen Körper an) Fazit: CTLA-4 hat eine hemmende Funktion im Immunsystem Immun- zelle CTLA-4 CTLA-4 Partnermolekül hemmendes Signal vereinfachte Darstellung Entscheidend: Dieses Ergebnis war nicht vorhersehbar. Nur dieses Mausmodell konnte die Entdeckung ermöglichen. Im Weiteren: CTLA-4 sitzt auf der Zelloberfläche mancher Immunzellen Es gibt ein Partnermolekül. Wenn dieses bindet, entsteht ein Signal in der Zelle mit CTLA-4 Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988

Nebenbei 2014: Bestätigung von Autoimmunität bei Fehlen von CTLA-4 beim Menschen Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6

1996: Blockade von CTLA-4 (durch Antikörper) verringert das Wachstum von Darmkrebs in Mäusen „Enthemmung“ des Immunsystems Kontroll-Antikörper Tumorgröße max. 95mm2 Antikörper gegen CTLA-4 Tumorgröße max. 30mm2 Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6

2010 Erste Anwendung von anti-CTLA-4 beim menschlichen Melanom Klar messbare, aber eingeschränkte therapeutische Wirksamkeit Behandlung MIT Antikörpern gegen CTLA-4: 20% überleben mit Antikörper gegen CTLA-4 Kontrolle: OHNE Antikörper gegen CTLA-4 Behandlung OHNE Antikörper gegen CTLA-4: unter 10% überleben Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23

2010: Erstmaliger gemeinsamer Einsatz von Antikörpern gegen CTLA-4 und PD-1 beim Melanom der Maus Ohne Behandlung (keine Antikörper) 0% überleben Antikörper gegen CTLA-4 ca. 10 % überleben Antikörper gegen PD-1 ca. 25% überleben Antikörper gegen PD-1 & CTLA-4 ca. 50% überleben Legende: Untreated Rechtecke (Blau) FVAX+ anti CTLA-4 Trapez (Rot) FVAX+ anti PD-1 Dreiecke (Gelb) FVAX+ anti PDL-1 Kreise (Schwarz) FVAX+ anti CTLA-4 / PD-1 verkehrte Dreiecke (Grün) FVAX+ anti CTLA-4 / PD-1 / PDL-1 Quadrate (Grau) Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280

2013: Erstmaliger Einsatz von Antikörpern gegen CTLA-4 UND PD-1 beim Melanom des Menschen Jede Kurve zeigt die Tumorgröße bei einem Patienten. Ergebnis: Ansprechrate: 53% Tumorreduktion: > 80% Patienten mit Endstadium III/IV! Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33

Die Krebs-Immuntherapie ist der wissenschaftliche Durchbruch des Jahres 2013 COVER Antibodies (pink) zoom toward a T cell (gray, with CTLA-4 receptor proteins shown in light blue), giving the T cell a push to attack tumor cells. In 2013, new therapies targeting the immune system to treat cancer surged ahead, with promising but still preliminary results in people with many forms of the disease. See the Breakthrough of the Year special section beginning on page 1431 and at http://www.sciencemag.org/news/2013/12/sciences-top-10-breakthroughs-2013-03. Image: Valerie Altounian/Science Image: © Valerie Altounian/Science

Seitdem: mehrere unabhängige Bestätigungen im Melanom Freigabe der Antikörper Erwerb und Einsatz ohne Studie möglich Rückkopplung von Dermatologen in großen Kliniken: Die Antikörper helfen

87% der Patienten sprechen auf die Behandlung an. 2015: Erfolg beim (sonst tödlichen) Rezidiv von Lymphknotenkrebs durch anti-PD-1 Ergebnis: 87% der Patienten sprechen auf die Behandlung an. Ansell et al. PD-1 Blockade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9

Weitere Tierversuche oder nicht? Aber beim Melanom reagieren die Hälfte der Patienten immer noch nicht! Weitere Tierversuche oder nicht?

Inhalt Folie 2 Gründe für Notwendigkeit von Tierversuchen Folie 4-5 schwarzer Hautkrebs (Melanom) und die geringe Überlebenszeit von Patienten im Stadium IV dieser Krankheit Folien 8 Informationen zur Entdeckung des Eiweißmoleküls PD-1; zuerst im Mausmodell, danach beim Menschen Folie 9-10 PD-1 Funktion: Hemmung des Immunsystems; Mausmodell ohne PD-1 resultiert in Autoimmun-Erkrankungen Folie 11 Blockade von PD-1 mit anti-PD-1 Antikörpern im Mausmodell schränkt Metastasierung des Melanoms ein Folie 12 Funktion von T-Zellen (besondere Immunzellen zur Abwehr von Tumoren und Viren. Folien 13,14 Mäuse mit chronischer Virusinfektion besitzen T-Zellen (wehren normalerweise das Virus ab) mit PD-1. PD-1 unterdrückt die T-Zell Funktion. Blockiert man PD-1 durch Antikörper werden diese T-Zellen wieder aggressiv und töten das Virus ab. Die Krankheit wird geheilt. Folie 15 Messbare, aber eingeschränkte Wirksamkeit von anti-PD-1 beim menschlichen Melanom Folien 17-19 vergleichbare Daten zu den Folien 8-10 für das CTLA-4 Eiweißmolekül mit ähnlich immun-unterdrückender Funktion wie PD-1 Folie 21 Blockade von CTLA-4 führt zu verringertem Tumorwachstum im Darmkrebs Mausmodell Folie 22 Messbare, aber eingeschränkte Wirksamkeit von anti-CTLA-4 Antikörpern beim menschlichen Melanom Folie 23 50% der Mäuse mit Melanom überleben, wenn PD-1 PLUS CTLA-4 gleichzeitig blockiert werden Folien 24 zeigen denselben positiven Effekt beim Menschen im Endstadium IV des Melanoms Folien 30 Quellenangaben mit Verlinkung Quellenangaben ohne Verlinkung

Quellenangaben Folie 5:Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634 Folie 8: Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895 Folie 8: Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706 Folie 10: Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151 Folie 11: Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144 Folie 13,14: Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687 Folie 15: Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454 Folie 17: Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270 Folie 17: Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905 Folie 19: Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988 Folie 20: Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6 Folie 21: Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6 Folie 22: Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23 Folie 23: Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280 Folie 24: Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33 Folie 27:Ansell et al. PD-1 Blocade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9

Quellenangaben Folie 5: Balch et al. Prognostic Factors Analysis of 17,600 Melanoma Patients: Validation of the American Joint Committee on Cancer Melanoma Staging System. J Clin Oncol. 2001, Vol 19, No 16, pp 3622-3634 Folie 8: Ishida et al. Induced expression of PD-1, a novel member of the immunoglobulin gene superfamily, upon programmed cell death. EMBO J. 1992 Vol 11, No. 11, pp 3887 – 3895 Folie 8: Shinohara et al. Structure and Chromosomal Localization of the Human PD-1 Gene (PDCD1). Genomics. 1994, Vol 23, pp 704-706 Folie 10: Nishimura et al. Development of Lupus-like Autoimmune Diseases by Disruption of the PD-1 Gene Encoding an ITIM Motif-Carrying Immunoreceptor. Immunity. 1999, Vol 11, pp 141–151 Folie 11: Iwai et al. PD-1 blockade inhibits hematogenous spread of poorly immunogenic tumor cells by enhanced recruitment of effector T cells. Int Immunol. 2005, Vol 17, No 2, pp 133–144 Folie 13, 14: Barber et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 2006, Vol 439, No 7077, pp 682-687 Folie 15: Topalian et al. Safety, Activity, and Immune Correlates of Anti-PD-1 Antibody in Cancer. N Engl J Med. 2012; Vol 366, No 26, pp 2443–2454 Folie 17: Brunet et al. A new member of the immunoglobulin superfamily - CTLA-4. Nature. 1987, Vol 328, pp 267 – 270 Folie 17: Dariavach et al. Human Ig superfamily CTLA-4 gene: chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human CTLA-4 cytoplasmic domains. Eur. J. Immunol. 1988, Vol18, pp 1901-1905 Folie 19: Waterhouse et al. Lmphoproliferative Disorders with Early Lethality in Mice Deficient in Ctla-4. Science. 1995, Vol 270, pp 985-988 Folie 20: Schubert et al. Autosomal dominant immune dysregulation syndrome in humans with CTLA4 mutations. Nat Med. 2014, Vol 20, No 12, 1410-6 Folie 21: Leach et al. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade. Science. 1996, Vol 271 No 5256, pp1734-6 Folie 22: Hodi et al. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma. N Engl J Med. 2010, Vol 363, No 8, pp 711-23 Folie 23: Curran et al. PD-1 and CTLA-4 combination blockade expands infiltrating T cells and reduces regulatory T and myeloid cells within B16 melanoma tumors. PNAS. 2010, Vol 107, No 9, pp 4275–4280 Folie 24: Wolchok et al. Nivolumab plus Ipilimumab in Advanced Melanoma. N Engl J Med. 2013, Vol 369 No 2, pp 122-33 Folie 27: Ansell et al. PD-1 Blocade with Nivolumab in Relapsed or Refractory Hodgkin´s Lymphoma. N Engl J Med. 2015, Vol 4, pp 311-9