Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay

Slides:



Advertisements
Ähnliche Präsentationen
In Kooperation mit der Abt. Toxikologie Universitätsklinikum Eppendorf
Advertisements

Integrin inside-out Signaltransduktion in der T-Zelladhäsion
CH2 CH3 + CH3 Ethylmethansulfonat (EMS).
Entwicklungsphysiologie WS 2009 / 2010
MARKER DEFINITION & ANWENDUNGSMÖGLICHKEITEN
DNA Allgemeine Informationen zur DNA Aufbau der DNA
Bakterien und Viren Bau und Vermehrung.
Docking von starren und flexiblen Proteinen
Lehrerfortbildung Juli 2011
Polymerase Chain Reaction
Genotypische und phänotypische Charakterisierung
Gentechnologie Definition Gentechnologie:
Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie
Fluoreszenzpolarisation
Etablierung neue Gene ? 1. Block-PCR Gradienten-PCR
Nachweis des Epithelialen Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR) und der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src in Urothelkarzinomzellen A. Melchior, J. Herrmann,
Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability David Summers Department of Genetics, Downing Street, Cambridge,
Proteinbiosynthese.
Biosynthese, chemische und technische Synthese von Aminosäuren
Protein-Protein Bindungsstellen
Pia, Sarah, Lisa Biologie Lk
Biochemisches Praktikum für Biologen
Nukleinsäuren. Nukleinsäuren Nukleinsäuren Berg et al. „Stryer“ Biochemistry, 2003.
Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie
DNA - Sequenzierstrategien
Protein- bestimmung.
VIREN - I nm Nucleoprotein Partikeln
Das Zentrale Dogma des Lebens
Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional
Die Nobelpreise in Chemie - in Physiologie
Genregulatorische Netzwerke Andreas Moll.
Institut für Mikrobiologie und Weinforschung
Termin Thema 20. Okt Microarray-Technologien, Grundlagen der Datenanalyse 27. Okt Normalisierung von Microarrays I Normalisierung von Microarrays II 3.
Examen Zellen Themen: Zellentheorie Wie man Zellen sehen kann
Denaturierung des DNA-Doppelstrangs
Thorsten Peter Daniel Kaplan
MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen
PIDD mediates Nf-κB activation in response to DNA damage
Ribonukleinsäure - RNA
SNP: Single Nucleotide Polymorphism
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
Dallinger Georg, 8.A BRG Schloss Wagrain
Translation und Transkription
Genetik 2 Biotechnologie.
Cytokin und TGF-ß Rezeptoren
Praktisches Training:
Prof. Dr. Helmut Erdmann Flensburg University of Applied Sciences
Gentransfer zwischen Bakterien in der Natur
Biochemie Vorlesung SS 2014
Die HIV-Infektion Alexander Pickert Lycée Jean-Piaget.
Das Gal4/ UAS System: Ein genetisches Schweizermesser Bertram Gerber, Stephanie Wegener, Thomas Hendel Universität Würzburg Supplement zu Gerber et.
Wie werden Gene vererbt?
1.DNA-Isolierung 2.PCR-Ansatz 3.Elektrophorese
Die identische Reduplikation
Genetik.
SD-TRP-URA X-gal –LEU-TRP Experiment A: Ergebnisse der X-gal-Topagar-Detektion der  -Galaktosidase-Aktivität aller in der ersten Serie isolierten.
Mechanismus der V(D)J Rekombination
Examen Zellen Themen: Vokabeln Zellentheorie Kennzeichen des Lebens
Die Rolle der Januskinase (JAK)-Signalwege
M13 Molekulare Physiologie Prof. Dr. Thorsten Mascher Dr. Diana Wolf Jara Radeck Philipp Popp Susanne Krause.
Dosiskompensation Drosophila melanogaster
Abschluss- besprechung
Universitätsklinik und Poliklinik für Gynäkologie
CRISPR/Cas9 Gentechnik
Grundübungen Mikrobiologie
Molekulare Zellbiologie
+ Herstellung eines transgenen Bakteriums
Kleines 1x1 ABCD Aufgaben Kleines 1x1 A · 8 = Lösung.
Welches Protein ist gesucht?
Transkriptionsfaktoren
 Präsentation transkript:

Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik

Analyse von Protein-Protein Interaktionen In vitro Methoden: (Co-)Immunpräzipitation (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) Affinitätschromatographie (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) Cross-linking (chemische Verknüpfung von Partnern) Protein-probing (markiertes Protein beweist eine Bindung) Phage-display (Suche nach Partner in einer Bibliothek) Protein-Chip In vivo Methoden: Fluorescence energy transfer (FRET) Hefe-Zwei-Hybrid Hefe-Tribrid-System Split-YFP

Saccharomyces cerevisiae 1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene biotechnologische Nutzung Modellorganismus Genetik, Biochemie, Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar

Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor Transkription der GAL-Gene unterdrückt GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene aktiviert

Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein für Identifikation von Bindungs-partner X = Prey = Target für Bait z.b. Bibliothek !!!! Verwendete Hefe-Stämme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!!

Yeast-Two-Hybrid: Prinzip β-Galactosidase ins Hefe-Genom integriert

Auxotrophie und Prototrophie auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können

Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme Klassische(genetische) Nomenklatur: ARG 2 Wildtyp Gen arg2 Mutiertes Gen arg2-9 Spezifische Mutation in Gen arg2-Δ Deletionsmutante ARG2::LEU2 Disruptionsmutante Arg2p Protein Arg+ Arg prototroph Arg- Arg auxotroph a-Zelle → a-factor, α-Rezeptor α-Zelle → α-factor, a-Rezeptor

Yeast-Two-Hybrid: Plasmide

Yeast-Two-Hybrid: Transformation Transformation: Hitzeschock bei 42°C LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA) PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen

Yeast-Two-Hybrid: Transformation Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo) Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep 1000 ng 129 ng/µl !! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs = 7,75 µl

Mating und Selecting 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16

Testen auf Protein-Protein Interaktion

Testen auf Protein-Protein Interaktion Mangelmedium SD-Leu-Trp-His: low stringency medium Galaktosidase-Assay α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor

Testen auf Protein-Protein Interaktion HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!!

Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: • Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 • Interaktion zwischen Proteindomänen • Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion • Identifizierung von neuen Interaktionspartnern

Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid hoch sensitiv in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen) billig, robust Screening Nachteile Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe Protein ist toxisch für Hefe BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) zeitliche und räumliche Expression der Proteine

MADS-BOX Domain Proteine K C DNA- binding Protein-protein interaction Transcriptional activation

ABC Modell – Arabidopsis thaliana

ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana

Liriodendron tulipifera (tulip tree) Family: Magnoliaceae Flower: Monoecious 9 tepals small genom size (784 Mbp) Habitat: Eastern North America

Amborella trichopoda most basal angiosperm Family: Amborellaceae small, evergreen unisexual flower : tiny, typically about 4-8 mm 5 – 8 tepals wind and insect pollination Habitat: New Caledonia A B A: female flower B: male flower

zu untersuchende Proteine Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2 AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function

Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell

Protein-Interaktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2. Tag

ß-Galactosidase Assay Kolonie-PCR 2. Tag Auswertung 1. Tag ß-Galactosidase Assay Kolonie-PCR

Was ist auffällig, anders als die Erwartung? Auswertung 1. Tag Kolonien zählen Wachstum? Wachstum? Wachstum? Was ist auffällig, anders als die Erwartung?

Kolonie-PCR Zellaufschluss mit NaOH Primer fwd PCR Primer rv Gel PCR-Produkt

Mastermix Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen 1 x 5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x 5 µl 27,5 µl dNTPs 2mM ddH2O 34 µl 187 µl Taq 1 µl 5,5 µl 45 µl (final 50 µl)

ß-Galactosidase Assay Indigo Farbstoff wird nicht sekretiert Zellaufschluss mit Chloroform!!

ß-Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Abdampfen lassen !!! Chloroform + Agar mit X-Gal 3h – 24 h

Organisatorische Infos !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! 3 Freiwillige zum Gele gießen Mittagspause nach dem X-Gal Test Praktikum Do und Fr Start pünktlich 8 Uhr Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr