Green Fluorescent Protein (GFP) Das GFP ist ein Protein von 238 Aminosäuren ursprünglich aus der Qualle Aequoria victoria isoliert. Diese erzeugt grüne Biolumineszenz. Das Protein kann in jedem Organismus ohne zusätzliche Cofaktoren exprimiert werden.
Anwendungen von GFP In vivo Verfolgung von Proteinen Aufzeichnung von Gen Expressionen Beobachtung von Zellpopulationen bzw. Differenzzierung Studium von Infektionen
Struktur des GFP Die Struktur von GFP zeigt eine Form die an eine Kanne erinnert. Sie wird als “β-Can” bezeichnet Dies besteht aus 11 β-Faltblättern und einer zentralen α-Helix
Fluorophor Fluorescenz wird durch einen Fluorophor erzeugt welcher im Zentrum des Proteins sitzt.
Die Struktur des Fluorophors Der Fluorophor entsteht in einem Tripeptide -Ser65-Tyr66-Gly67- Dessen Bildung geschieht auto-katalytisch
Mechanismus der Fluorophor-Bildung Durch Ringbildung entsteht ein konjugiertes aromatisches System.
Was ist Fluorescenz? Ein Molecül absorbiert ein Photon und hebt es auf eine höhere Schale (Energielevel). Nach 10-9 to 10-4 Sekunden fällt das Elektron auf die Ausgangsschale (Energie-level) zurück und emittiert ein Photon. Das emittierte Photon hat eine geringere Energie (größere Wellenlänge) als das absorbierte. Konjugierte und aromatische Syteme zeigen oft Fluorescenz
Spektrale Charakteristik des wild-Typ GFP Anregungsmaximum bei 395 nm (UV) mit einem kleinen peak bei 475 nm (blau) Emission bei 508 nm (grün) Quantenausbeute zwischen 0.72 to 0.85
Bedeutung von Wasserstoffbrücken zur Fixierung des Moleküls Der isolierte Fluorophor fluoresziert nicht. H-Brücken zu nahegelegenen Seitenresten erzeugen erst Fluorescenz
Mutationen führen zu blauen und roten fluoresierenden Proteinen Ser65 nach Thr Phe64 nach Leu Tyr66 nach His Tyr145 nach Phe