Transponierbare Elemente: Ty-Elemente in S. cerevisiae Marlen Beer Datum: 15.01.2013 Modul 13/14 - Prof. Dr. König Johannes Gutenberg-Universität Mainz Mikrobiologisches Seminar im WS 2012/13

Definition transponierbarer Elemente engl. transposable elements to transpose: versetzen, umsetzen mobile genetische Elemente, die Fähigkeit zur Transposition besitzen Transposition: Vorgang, bei dem eine DNA-Sequenz innerhalb des Wirtsgenoms an eine andere Stelle versetzt (transponiert) wird → „Jumping Genes“ allgegenwärtig in Pro- und Eukaryoten → “Genom-Parasiten”

Bedeutung transponierbarer Elemente erstmals beschrieben von Barbara McClintock (1916-1992) während ihrer Untersuchungen zur Genetik von Maispflanzen → Nobelpreis für Medizin (1983) galten lange als funktionslos → „Junk-DNA“ werden inzwischen als evolutionär notwendiger Bestandteil genomischer Flexibilität gesehen Vergrößerung des Genoms chromosomale Umstrukturierungen durch Rekombination: Duplikationen, Insertionen, Inversionen, Deletionen, Translokationen

Einteilung transponierbarer Elemente DNA-Transposons Retroelemente DNA-Sequenzen, die ohne RNA- Zwischenstufe ihren Lokus im Genom verändern können Transpositions-Mechanismus: konservativ „cut and paste“ werden direkt aus Donor-Stelle ausgeschnitten und an einer anderen Stelle im Wirtsgenom wieder eingefügt replikativ „copy and paste“ alte Sequenz bleibt an Donor-Stelle erhalten und Kopie wird an einer anderen Stelle im Wirtsgenom eingefügt DNA-Sequenzen, die mittels RNA-Zwischenstufe ihren Lokus im Genom verändern können Transpositions-Mechanismus: Retrotransposition Abb.2: Schematischer Mechanismus der Retrotransposition Abb.1: Schematischer Mechanismus der konservativen bzw. replikativen Transposition

LTR-freie-Retroelemente Long Terminal Repeat (LTR)-Retroelemente Einteilung nach: Fähigkeit zur Retrotransposition aus eigener Kraft Vorhandensein von flankierenden, repititiven Sequenzen Nicht-autonome Retroelemente kodieren für keine Proteine und können sich nur mit Hilfe jener der autonomen Elemente bewegen Autonome Retroelemente kodieren selbst für die Proteine, die für ihre Mobilität verantwortlich sind LTR-freie-Retroelemente Long Terminal Repeat (LTR)-Retroelemente Retroviren mit funktionsfähigem env-Gen für Proteinhülle

Retrotranspositions-Mechanismus Transkription des integrierten DNA-Elements in mRNA Translation der Transkripte: Synthese der Enzyme, die für Transposition notwendig sind Reverse Transkription der mRNA zurück in DNA durch Reverse Transkriptase Integration der kopierten cDNA-Moleküle an beliebigen neuen Stellen ins Wirtsgnom Abb.3: Transkriptionszyklus eines Retrotransposons

Genomweite Untersuchung von Organisation und Vielfalt der Ty-Elemente von S. cerevisiae engl. Ty = transposons in yeast Hefe Saccharomyces cerevisiae wichtiger Modellorganismus zur Erforschung der Biologie von LTR-Retrotransposons → gesamte Nukleotid-Sequenz verfügbar Auswertung organisatorischer und evolutionärer Tendenzen von Ty-Insertionen auf genomischer Ebene

Klassifikation von Ty-Elementen Ty1/copia-Superfamilie Organisation der pol-Gene: Integrase liegt vor Reverser Transkriptase Vertreter : Ty1-, Ty2-, Ty4- und Ty5-Elemente Ty3/gypsy-Superfamilie Organisation der pol-Gene: Integrase liegt hinter Reverser Transkriptase Vertreter: Ty3-Elemente Abb.4: Schematische Darstellung des grundlegenden Aufbaus von Elementen der Ty1/copia- bzw. Ty3/gypsy-Familie

Struktur von Ty-Elementen funktionsfähige, mobile Ty-Elemente benötigen 2 terminale LTRs ORF(s) der internen Region kodieren für: gag-Strukturprotein: 'gruppen-spezifisches Antigen‘ pol-Polyprotein mit funktionellen Domänen für: Reverse Transkriptase: Retrotranskription (RT) Ribonuklease H (RH) Protease: Prozessierung des Polyproteins (PR) Integrase: Einlagerung der DNA-Kopien ins Genom (IN) Ty1-, Ty2, Ty3- und Ty4-Elemente Proteine der ORFs werden über Frameshift-Mechanismus exprimiert → Bildung 2er Protein, die weiterer Reifung unterliegen Ty5-Elemente benutzen keinen Frameshift-Mechanismus → durchgehenden langer ORF für Gag-Pol Abb.5: Struktur von Ty1-, Ty2-, Ty3-, Ty4- und Ty5-Elementen

Identifikation von Ty-Elementen Methode: Screening der Genomsequenz mit Ty1- bis Ty5-LTR-Eingabesequenzen Ergebnis: 331 identifizierte Ty-Insertionen 15% komplette Elemente 85% LTR-Fragmente oder solo-LTR Tab.1: Chromosomale Verteilung von Ty-Elementen

Phylogenetische Analyse aller vollständigern Ty1- und Ty2-LTRs Methode: Alignment aller vollständigen Ty1- und Ty2-LTRs und Konstruktion eines neighbor-joining Baumes interamiliäre Verwandschaftsbeziehungen: Ty2-Elemente ausschließlich in LTR-Sequenz-Cluster 3+4 Insertion bzw. Deletion eines einzelnen Basenpaares unterscheidet fast identische Ty1- und Ty2-LTRs → Ty2-Elemente können als Ty1-Subfamilie gesehen werden → unabhängige Evolution intrafamiliäre LTR-Sequenzdiversität: bei Ty1-, Ty2- und Ty5-Elementen hoch → bestehen seit langer Zeit bei Ty3- und Ty4-Elementen gering → relativ neu hinzugekommen Abb.6: Neighbour-joining Baum vollständiger Ty1- und Ty2-LTRs

Analyse der kodierenden Sequenzen vollständiger Ty1- und Ty2-Elemente Methode: Alignment der AS-Sequenzen von GAG und POL intrafamiliäre AS-Sequenzunterschiede in GAG besonders bei Ty1-Elementen (73.9% invariante AS) POL stärker konserviert als GAG Ty2-Elemente besitzen weniger invariante AS → sind sich ähnlicher als Ty1-Elemente Tab.2: AS-Sequenzidentität von Ty1- und Ty2-Elementen

Identifikation einer Ty1-Subfamile (Ty18) Methode: Phylogenetische Analyse aller GAG-Nukleotidsequenzen von vollständigen Ty1-Elementen Ergebnis: 3 Elemente größtenteils verantwortlich für Heterogenität GAG-Sequenzen scheinen sich unabhängig entwickelt zu haben nach Ausschluss bei Sequenzvergleichen stieg Anteil invarianter AS zwischen übrigen GAG-Sequenzen auf 94,1% Abb.7: Neighbor-joining Baum der GAG-Nukleotidsequenzen von Ty1- und Ty2-Elementen

Chromosomales Verteilungsmuster von Ty-Elementen im Genom von S Chromosomales Verteilungsmuster von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae machen insg. >377 kb des 12.1 Mb Genoms aus = 3,1% Anteil Ty-Elemente/Chr: 0.63% - 4.3% Inserionsdichte/kb DNA variiert < 4-fach zwischen untersch. Chr geringfügig höher für kleinere Chr → zusätzliche Sequenzen stabilisieren 3 kleinsten Chr ~ 1 Insertion/25.2 kb DNA 3 größten Chr:~ 1 Insertion/39.4 kb DNA einigen größeren Bereichen fehlen Ty-Insertionen komplett, z.B. 416-kb lange Region auf Chr XIV Chromosomales Verteilungsmuster ist nicht zufällig… Abb.8: Chromosomales Verteilungsmuster von Ty-Elementen

Regionale Zielsequenzpräferenz von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen ausschlaggebender Faktor für chromosomales Verteilungsmuster sind tRNA-Gene → tRNA-Gen-gerichtete Integration Methode: Bestimmung der Lage aller Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elemente relativ zu tRNA-Genen Ergebnis: 90.4% sind mit Klasse-III-Genen assoziiert, d.h. integrieren bevorzugt im Bereich von 750 Basen in der Nachbarschaft von tRNA-Genen oder anderen Klasse-III-Genen, die durch RNA-Pol-III transkribiert werden 66% der tRNA-Gene sind im Umkreis von 750-Basen mit Ty-Insertionen assoziiert durchschnittlich 1.2 Insertion/tRNA-Gen (einige sind Integrations-Hotspots) Tab.3: Chromosomale Organisation von Ty-Elementen

Regionale Zielsequenzpräferenz von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen Abb.8: Lage aller Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elemente relativ zu tRNA-Genen auf Chr III und V Ty5-Elemente integrieren hingegen bevorzugt in der Nähe von Telomeren

Konsensus-Sequenzen der Zielorte von Ty1-, Ty2-, Ty3- und Ty4-Elementen Target site duplications (TSD) meist 5 bp lange gleichgerichtete Duplikationen der Zielsequenz an Flanken des Transposons Entstehen durch versetzte Schnittstellen nach Integration werden Einzelstränge durch Reparaturenzyme wieder aufgefüllt und ligiert Abb.9: Schematische Darstellung der Entstehung von TSD Methode: Bestimmung der Konsensus-Sequenzen der Zielorte von 118 Ty1–Ty4 LTRs, die flankiert waren von perfekten 5-bp TSD Ergebnis: hinsichtlich der Integrationsstellen besteht starke Präferenz für A oder T in den mittleren 3 Positionen Tab.4: TSD-Konsensus-Sequenz

Genomische Umstrukturierung durch Rekombination von Ty-Elementen – Bsp Rekombination eines zirkulären solo-LTR-Ty1-Elements mit einem Ty-Element auf Chr X erzeugt Tandem-Ty1-Element Abb.10: Beispiel eines Rekombinations-Ereignisses zwischen Ty1-Elementen

Genomische Umstrukturierung durch Rekombination von Ty-Elementen – Bsp Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII auf versch. Chr duplizierte, sub-telomerische Lage einiger Ty1-Insertionen (targeting exceptions) ist Ergebnis von Rearrangements im Anschluss an Integration Abb.11: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII Rekombinations-Ereignis: reziproker Austausch zwischen 2 Ty1-Elementen verschiedener Chromosomen führt zur Entstehung von 2 Ty1-Elementen mit unterschiedlichen 5’- und 3’-target site sequences Rekombination zwischen den LTRs führte zum Verlust der internal coding sequences Ergebnis: Ty1-solo-LTR-Insertion nahe des rechten Telomers von Chr I Abb.12: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII Duplikations-Ereignis: Duplikation der telomerischen Ty1-solo-LTR-Insertion auf dem rechten Arm von Chr I sowie der dieses flankierenden Sequenzen auf das linke Telomer von Chr I Duplikation der telomerischen Ty1-solo-LTR-Insertion auf dem rechten Arm von Chr I sowie 25 kb der dieses flankierenden Sequenzen auf den rechten Arm von Chr VIII Abb.13: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII

Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII Transpositions-Ereignis: Insertion eines unabhängigen Ty1-Elements auf Chr VIII (~12 kb telomere–proximal to the solo Ty1 LTR) Ty1/Ty2 neighbor-joining Baum unterstützt hohen Verwandtschaftsgrad zwischen duplizierten solo-LTRs Abb.14: Entstehung der telomerischen Organisation der Ty1-Elemente auf Chr I und VIII Abb.15: Ausschnitt aus dem Ty1/Ty2 neighbor-joining Baum

Ungewöhnliche Paare von Ty-Elementen Insertion von 2 Ty-Elementen in gegenläufiger Orientierung mit geringem Abstand zueinander Chr XVI hat größtes Potential für genetische Instabilität, da Elemente derselben Ty-Familie beteiligt Abb.16: Inverted Ty Pairs Insertion eines Ty-Elements innerhalb eines anderen Abb.17: Compound Insertion auf Chr X

Datensätze der Untersuchung von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae lassen erkennen, … welche Mechanismen Ty-Elemente entwickelt haben, um im Genom bestehen zu können wie Ty-Elemente die Genom-Organisation beeinflussen können wie Transposition und Rekombination das Genom im Laufe der Zeit umstrukturiert haben dienen als Ausgangspunkt für vergleichende Analysen mit anderen Hefe-Stämmen, verwandten Arten und komplexeren Genomen, sodass Rückschlüsse auf die Biologie anderer eukaryotischer Retrotransposons gezogen werden können

Ergebnisse der Studie von Ty-Elementen im Genom von S. cerevisiae verschiedene Ty-Elemente entstanden durch Baseninsertionen und –verluste Ty-Elemente sind dynamisch: manche Familien vermehren sich, andere sterben aus Beeinflussung der Genom-Organisation… direkt, durch Mechanismen der zielgerichteten Integration Verteilungsmuster bestimmt durch Orte von Pol III-Transkription bzw. telomerischem Chromatin AT-reichen chromosomalen Regionen → stumme, transkriptional inaktive Regionen typischerweise ohne kodierende Informationen → lethale Mutationen werden verhindert, sodass Ty-Elemente im Genom bestehen können indirekt, durch Rekombination zwischen Ty-Elementen

Das war‘s… Danke für eure Aufmerksamkeit!

Quellenverzeichnis http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/biotutor_2004/viren.htm http://gydb.org/index.php/Intro http://books.google.de/books?id=MUQthlDcj3EC&pg=PA138&lpg=PA138&dq=%22mobile+genetische+elemente%22&source=bl&ots=5VzQCrm77p&sig=Y8ahCmCKIHFV-ksQadpqDsBCVC8&hl=de&sa=X&ei=-tnWUPatPIySswbFoYDYDg&ved=0CDQQ6AEwAA#v=onepage&q=%22mobile%20genetische%20elemente%22&f=false http://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/07/07H062/t3.pdf http://www.public.iastate.edu/~voytas/ http://biochimica.unipr.it/yeast/tRNA.html; http://www.qucosa.de/fileadmin/data/qucosa/documents/1168/1091608193375-2811.pdf http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0960982201001683-gr1.jpg http://online-media.uni-marburg.de/biologie/genetik/boelker/VL-Molekulargenetik/VL-Transposition3.pdf