„ Spurenabnahme: Eine vergleichende Studie zur DNA-Extraktion aus herkömmlichen und beflockten Tupfern“ Henske B, Krüger C, Nagy M Abteilung für Forensische Genetik, Institut für Rechtsmedizin, Charité , Universitätsmedizin Berlin Der wesentliche Schritt in der PCR-basierenden Spuren-Analyse ist eine möglichst vollständige dabei aber hochreine DNA-Isolierung, die mit einer möglichst optimalen Spurenaufnahme im Niedrigzellbereich beginnt. Es sollte deshalb eine effiziente Methode zur Spurenabnahme eingesetzt werden, welche eine maximale DNA-Ausbeute erzielt. Es wurden die DNA-Extraktionen aus der klassisch gewickelten Tupfer-Methode (Prionics AG) verglichen mit einer sogenannten beflockten Tupfertechnik (Copan), die Nylonborsten gezielt auf den Tupferschaft applizieren. Copan hat 2004 die sogenannten beflockten Tupfer entwickelt und patentiert. Ziel dieser Tupferentwicklung war eine Verbesserung der Präanalytik, verbunden mit einer Automatisierung. Die neuen Speichelentnahme-Sets und DNA-Spurensicherungs-Kits werden nach Information der Firma Copan vollautomatisch ohne menschliche Manipulation hergestellt, nach Zusammenbau der Tupfer/Röhrchen-Einheit mit Ethylenoxid begast und das Silika-Trocknungsmittel unter Reinraumbedingungen von außen appliziert. Eine aufwendige Qualitätskontrolle soll die Freiheit von humaner DNA, DNasen, RNasen und Inhibitoren belegen. Von allen Mitarbeitern liegen die DNA-Profile vor und werden auf Verlangen zur Verfügung gestellt. 2. Parallele Spurenabnahmen von definierten Zellmengen auf forensisch relevanten Unterlagen Versuchsdurchführung Vorbereitung der Modell-Spurenproben Lymphozytenzellring aus Blut Herstellung der definierten Zell-Lösung 200 Zellen/µl Kontrolle der Zellmengen über mikroskopische Auszählung (5x) Auftragung der definierten Zellmenge auf verschiedene forensisch relevante Unterlagen Trocknung der Proben 24 h bei 25°C Lyseschritt Lyse-Puffer: 200 µl Detergentien-Puffer + Proteinase K (25µl) Temperatur: 56°C Zeit: 15 min mixen DNA-Extraktion Automat: QIAsymphony (Fa.QIAGEN) Protokoll: Investigator CW_200_H2O_v1 Ausgangsvolumen 200 µl Elutionsvolumen 30 µl DNA-Messung DNA-Quantifizierung mittels UV-Spektrophotometrie bei 260 nm im GeneQuant Fotometer (Amersham Pharmacia Biotech) Auftragung von Zellen auf forensisch relevante Unterlagen (80 µl mit einer Zellkonzentration von 200 Zellen/µl) Unterlagen aus Keramik, Glas, Metall, Pappe, Stoff, Leder, PE-Folie 48 Parallel-Ansätze der Spurenabnahme Vergleichende DNA-Messung nach Extraktion Ergebnis Prionics-Tupfer Copan-Tupfer Wiederfindungsrate Ø 77,7 % ± 10,7 % 82,2% ± 10,0% DNA-Elutions-Differenz Ø + 4,8 ng Schreibpapier* +11,5 ng Zeichenkarton* + 2,1 ng Pappe* + 6,6 ng PE-Folie* + 5,0 ng Stoff* + 5,5 ng * aus jeweils 5 parallelen Auftragungen Elektronenmikroskopische Fotografie, Abbildungen über den unterschiedlichen Aufbau Klassischer gewickelter Tupfer Er besteht aus ca. zwei Kilometer Fasermaterial. Beflockter Tupfer Er besteht aus lediglich 6 Meter definiert geordneter Fasern. 3. Parallele Spurenabnahmen an selektiven Routine-Proben (DNA-Kontaktspuren) Schematische Darstellung DNA-Kontaktspuren (Routine-Proben parallel abgenommen) an Spurenträgern wie Metallstangen, Gummischlagstöcke, Einweg- handschuhe, Abschleppseile, Wagenheber, Kabelbindern, Trink- becher, Zeitungsblätter, Briefbögen, Kleidungsstücke, Pistolen Vergleichende Erstellung von SE-FilerPE Applied Biosystems -Profilen nach DNA- Extraktion (7,5 µl bzw. Aufkonzentrierungen von 25 µl aus 50 µl Elutionsvolumen wurden in der PCR-Reaktion eingesetzt) 1. Parallele Entnahmen von Mundschleimhautzellen Parallele Abnahmen mit den Speichel-Entnahmestäbchen der beiden Hersteller von der linken bzw. rechten Wange 24 parallele Abnahmen Vergleichende DNA-Messung nach Extraktion Ergebnis Prionics-Tupfer Copan-Tupfer „ohne Befund“ 74% 74% „partielles SEfilerTM Profil“ 22% 9% (5/11 Loci mindestens) „komplettes SEfilerTM Profil“ (11/11 Loci) 4% 17% Ergebnis Prionics-Tupfer Copan-Tupfer DNA-Konzentration Ø 3,5 ng/µl 4,4 ng/µl DNA-Konzentrations- Differenz Ø + 0,9 ± 1,1ng/µl Klassischer gewickelter Tupfer Die Probe diffundiert in die Fasermatrix und wird zurückgehalten. Bei der Elution kann sich Probenmaterial unwiederbringlich verfangen. Beflockter Tupfer Ein großes Probenvolumen wird durch die Tupfer-Oberfläche absorbiert. Die Elution des Probenmaterials soll fast vollständig sein. Untersucht wurde die parallele Entnahme von Mundschleimhautzellen sowie die Auftragung von definierten Zellmengen auf verschiedenen spurenrelevanten Oberflächen. Die gewonnene DNA wurde quantifiziert und die DNA-Ausbeute verglichen. Darüber hinaus wurde an ausgewählten Tatortspuren ein direkter Vergleich beider Abnahme Set’s über die Qualität in STR-Multiplex-Ansätzen durchgeführt. Sowohl bei der parallelen Entnahme von Mundschleimhautzellen als auch bei der Abnahme von ausgewählten Modell- und Routine-Spurenproben zeigte sich in unseren Untersuchungen ein Vorteil in der DNA-Ausbeute für die Copan-Tupfer. Beide Hersteller arbeiten mit Ethylenoxid-Begasung und Trocknungsmittel. Die zur Verfügungstellung von Mitarbeiter-Profilen ist uns bisher nur von der Firma Copan bekannt. Die Muster der DNA-Spurensicherungs-Kits beinhalten allerdings im Gegensatz zu den Prionics-Abnahme-Sets vorerst nur die Röhrchen mit den Tupfern. Barcode-Etiketten, separate Aufkleber für Vorgangsdaten sowie separate Siegel zum festen Verschluss der Proben werden nach Kundenabsprache gefertigt.