Aerobe Atmung und Abbau

Organismus des Tages Pseudomonas aeruginosa Systematik Klasse: Gammaproteobacteria Ordnung: Pseudomonadales Familie: Pseudomonadaceae Gattung: Pseudomonas Art: Pseudomonas aeruginosa Aerugo: griechisch Grünspan, Glänzt auf Agar metallisch-grün Speziesname bezieht sich auf die blau-grüne Färbung des Eiters in Wunden

The uncultured majority 13 The uncultured majority 9 1205 4 n = published species 1367 220 8 Black: 12 original Phyla (Woese 1987) many pure cultures White: 14 new phyla since 1987 some isolates Gray: 26 candidate phyla no isolates 1808 91 What are they all doing ? 11 24 25 Rappé & Giovannoni (Annu Rev Microbiol, 2003) Keller & Zengler (Nat Rev Microbiol, 2004)

Eigenschaften Aerobes Bakterium, teilweise anaerob Ein bedeutender nosokomialer Keim. Definition: Unter einer nosokomialen Infektion (Krankenhausinfektion) wird jede durch Mikroorganismen hervorgerufene Infektion verstanden, die im zeitlichen Zusammenhang (48 h) mit einem Krankenhausaufenthalt oder einem Aufenthalt in einer anderen medizinischen Einrichtung steht, unabhängig davon, ob Krankheitssymptome bestehen oder nicht. „Nosokomien“ hießen die Räumlichkeiten in den Heilstätten im alten Griechenland (z.B. in Epidauros), in denen Patienten mittels eines Heilschlafes behandelt wurden. Wächst in und verwertet Detergenzien Es verursacht z. B. nach Verbrennungen auf Wunden Infektionen, bei zystischer Fibrose oft Pneumonien, v. a. bei Immunsupprimierten und AIDS-Patienten. Harnwegsinfekte, Enterocolitis, Meningitis. Zur Hämolyse fähig und produziert Toxine. In der Tiermedizin ist P. aeruginosa an lokalen eitrigen Infektionskrankheiten beteiligt; der Speziesname bezieht sich auf die blau-grüne Färbung des Eiters.

P. aeruginosa ist besonders häufig bei Cystic Fibrosis Patienten CF-Patienten: Defekt in Chlorid Kanälen Wenig Flüssigkeit und geringe Effizienz, Organismen auszuhusten Chronische Infektionen über Jahrzehnte P.ae. Biofilme schützen sich gegen Entzündungsreaktionen. Ev. Rolle von Homoserinlactonen zur Imunrepression Schutz gegen Antibiotika Hohe Resistenzraten und Mutatorstämme

Eigenschaften Degradation of n-alkanes in diesel oil by Pseudomonas aeruginosa strain WatG (WatG) was verified in soil microcosms. bioavailability of phenanthrene (PHE) enhanced in the presence of rhamnolipid biosurfactant and/or a biosurfactant-producing bacterium, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027. Kann Detergentien wie SDS abbauen others

Generelle Darstellung der aeroben Atmungskette Antimycin A 1) NADH-Dehydrogenase 2) Succinat dehydrogenase 3) Ubichinol-Cytochrom-C-oxidoreduktase 4) Cytochrom-C-oxidase Periplasma z.B. Amytal 2 H+ 4 H+ 2 H+ 2 H+ Cyt-C ox/red ½ O2 2e- Q [2Fe2S] Cyt a/a3 2e- FMN Cyt b Cyt c1 2e- Die Cytochrom C oxidase ist durch Cyanid, CO und Azid hemmbar, weil die Häm-Eisenatome nur 5 Koordinationstellen haben. Im Gegensatz dazu haben die Häm des Cyt b Komplexes alle Koordinationsstellen des Eisens belegt. QH2 [4Fe4S] [3 Cu] [FexSx] 2 H+ 4 H+ 2 H+ H2O 2 H+ 2 H+ NADH + H+ NAD+ CN-, CO, N3- Cytoplasma 2e- + 2H+

Alternative aerobe Atmungsketten Bei niedrigen O2-Partialdrücken Feinanpassung Keine Cytochrom-c-Oxidase (Endoxidase, Oxidase negativ) Kein Cytochrom bc1 complex Chinoloxidasen oxidieren direkt das Ubichinon entweder mit (Häm 0) oder ohne (Häm d) Protonenpumpe NADH-Dehydrogenase II Expression (keine Protonenpumpe) anstatt NADH-DH I

a) Grundschemata der Elektronentransportkette in den Membranen der Mitochondrien und vieler Bakterien a) NADH + H+ NAD+ NADH-Dehydrogenase I FMN FeS 4 H+ 2 H+ Q Ubichinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktase Cyt bc1 FeS 2 H+ Cyt c Cytochrom-c-Oxidase Cyt aa3 Cu 2 H+ O2

Grundschemata der Elektronentransportkette in Paracoccus denitrificans b) Substrat Substrat-2H-Q- Reduktase 4 H+ 4 H+ Q 2 H+ 2 H+ Ubichinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktase Cyt bc1 FeS Chinol- Oxidase Cyt c Cyt o 2 H+ 2 H+ Cyt c Cytochrom-c-Oxidase Cyt o Cytochrom-c-Oxidase Cyt aa3 Cu 2 H+ 2 H+ O2 O2 O2

Grundschemata der Elektronentransportkette in Escherichia coli Substrat Substrat-2H-Q- Reduktase 4 H+ 4 H+ 2 H+ Q 2 H+ Chinol- Oxidase Cyt b Cu Cyt o Chinol- Oxidase Cyt b Cyt d 2 H+ 2 H+ 2 H+ 2 H+ O2 O2 Geringe Affinität für O2, KM ca. 3 µM Hohe Affinität für O2, KM ca. 0,1 µM

Grundschemata der Elektronentransportkette in den Membranen der Mitochondrien und vieler Bakterien Mitochondrien und viele Bakterien b) Paracoccus denitrificans c) E. coli NADH + H+ Substrat Substrat NAD+ Substrat-2H-Q- Reduktase Substrat-2H-Q- Reduktase NADH-Dehydrogenase FMN FeS Q Q Q Ubichinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktase Cyt bc1 FeS Chinol- Oxidase Cyt c Cyt o Chinol- Oxidase Cyt b Cu Cyt o Chinol- Oxidase Cyt b Cyt d Ubichinol-Cytochrom-c-Oxidoreduktase Cyt bc1 FeS Cyt c Cyt c Cytochrom-c-Oxidase Cyt aa3 Cu Cytochrom-c-Oxidase Cyt o Cytochrom-c-Oxidase Cyt aa3 Cu O2 O2 O2 O2 O2 O2

Berechnung der freien Enthalpie mit realen Konzentrationen Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie einer Reaktion unter Standardbedingungen (alle Reaktanden in 1 M Konzentration, 300 K und pH = 7 ergibt ∆G0‘ Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie unter realen Konzentrationen Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ (T= 300 K) ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q (cA)a x (cB)b Hier Rechenbeispiel mit den freien Energien für Acetat und SO42- Tabellen austeilen mit freien Bildungsenthalpien C2H3O2- + SO42- ↔ 2 HCO3- + HS-

Berechnung mit realen Konzentrationen Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sulfat ist? C2H3O2- + SO42- ↔ 2 HCO3- + HS- Produkte minus Edukte = 2 x (- 586,85) + (+ 12,05) – (- 369,41 + (- 744,63)) = - 1161,2 + 1114,04 = - 47,16 kJ/mol ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q (cA)a x (cB)b 1) ∆G = - 47,16 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,010 HCO3-)2 x (0,001 HS-)1 (0,010 Acetat)1 x (0,010 Sulfat)1 = - 47,16 kJ/mol + 5,75 kJ/mol log 0,001 = - 47,16 kJ/mol – 17,25 kJ/mol = - 47,16 kJ/mol – 17,25 kJ/mol = - 64,41 kJ/mol (Wieviel ATP entspricht das?) Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden: 1) Acetat 10 mM, 1 mM HS-, 10 mM Bicarbonat, 10 mM Sulfat

Merke! Tabellenwerte sind schon auf wässrige Lösungen berechnet. D.h. für Wasser wird nicht 55,5 M eingesetzt sondern 1. Das gleiche gilt für Protonen, solange wir mit den G0‘ Werten für pH 7.0 rechnen. Bei Gasen wird wegen der geringen Löslichkeit der Partialdruck angegeben.

Berechnung der freien Enthalpie mit realen Konzentrationen Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie einer Reaktion unter Standardbedingungen (alle Reaktanden in 1 M Konzentration, 300 K und pH = 7 ergibt ∆G0‘ Bestimmen der Änderung der freien Enthalpie unter realen Konzentrationen Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q (cA)a x (cB)b Hier Rechenbeispiel mit den freien Energien für Acetat und Sauerstoff Tabellen austeilen mit freien Bildungsenthalpien C2H3O2-+ 2 O2 ↔ 2 HCO3- + H+

Berechnung mit realen Konzentrationen Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sauerstoff ist? C2H3O2- + 2 O2 ↔ 2 HCO3- + H+ Produkte minus Edukte = 2 x (- 586,85) + (- 39,9) – (- 369,4 – 2 x 0) = - 1213,6 + 369,4 = - 844,2 kJ/mol ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q (cA)a x (cB)b 1) ∆G = - 844,2 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,010 HCO3-)2 (0,010 Acetat)1 x (0,23 O2)2 = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol log (10-2) - log (0,0529) = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (-2 + 1,28) = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (- 0,72) = - 844,2 kJ/mol – 4,14 kJ/mol = - 840,06 kJ/mol Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden (geschlossenes Gefäß): 1) Acetat 10mM, 23 % O2, 10 mM Bicarbonat, pH 7,0

Berechnung mit realen Konzentrationen Angenommene Reaktion mit aA + bB ↔ pP + qQ ∆G0‘ für Acetatoxidation mit Sauerstoff ist? C2H3O2- + 2 O2 ↔ 2 HCO3- + H+ Produkte minus Edukte = 2 x (- 586,85) + (- 39,9) – (- 369,4 - 0) = - 1213,6 + 369,4 = - 844,2 kJ/mol ∆G = ∆G0‘ + RT ln (cP)p x (cQ)q (cA)a x (cB)b 2) ∆G = - 844,2 kJ/mol + 2,5 kJ/mol 2,3 log (0,01 HCO3-)2 (0,0001 Acetat)1 x (0,01 O2)2 = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (log 104) = - 844,2 kJ/mol + 5,75 kJ/mol (4) = - 844,2 kJ/mol + 23 kJ/mol = - 821,2 kJ/mol Gegenüber – 840,06 kJ/mol bei 23 % Ausgangswerte die wir normalerweise für Kultivierung verwenden (geschlossenes Gefäß): 2) Acetat 0,1 mM, 1 % O2, 10 mM Bicarbonat, pH 7,0 Kurzes Rechenbeispiel wieviel Protonen über die Membran bei Acetat.

Denksportaufgabe Minigruppe Wieviele Protonen pumpt das Mitochondrium pro Acetat über die Membran? Wieviel Energie ergibt das und wieviel ist das im Vergleich zur Standardenergie der Reaktion? Was bedeuted das?

Warum alternative Wege der aeroben Atmungskette? Die Energetik alleine kann also nicht der Grund sein, dass bei Sauerstoffmangel andere Endoxidasen mit weniger Energiegewinn genutzt werden. Es ist die Affinität der Enzyme zum Sauerstoff, die hier entscheidend wird. Irgendwann wird der Sauerstofffluss limitierend und die Konzentration wird zu klein um noch vernünftige Kinetiken zu erlauben (Michaelis Menten, Affinität)

Schutz vor Sauerstoff Obligat aerobe Organismen Fakultativ aerobe/fakultativ anaerobe Microaerophil Aerotolerante Obligat anaerobe

Schutz vor Sauerstoff Catalase Superoxiddismutase 2 H2O2 → 2 H2O + O2 Superoxiddismutase 2 O2- + 2 H+ → H2O2 + O2 Glutathion-Peroxidase H2O2 + 2 GSH → GSSG + 2 H2O R-OOH + 2 GSH → GSSG + ROH + H2O

Aerobe Biochemie von Schadstoffabbau Monooxygenasen Alkane Dioxygenasen, Toluol, PAK Ringspaltende Dioxygenasen, Epoxyd-bildende Monoxygenase (Benzol)

Welche Schadstoffe sind wichtig?

Biodegradation pathways, aerobic Oxygen is special because it is needed as electron acceptor and co-substrate Oxygenase reactions for alkanes and aromatic hydrocarbons

Aerobic degradation of alkanes

Benzol, Phenol Abbau Dioxygenase Dehydrogenase Benzol cis-1,2-Dihydro- XH2 X X XH2 Benzol cis-1,2-Dihydro- 1,2-dihyroxy- benzol Brenz- Catechin (Catechol) O H Phenol Brenzcatechin (Catechol) O2 + XH2 H2O + X Monooxygenase

Konvergente Abbauwege l k y l C H O H C O O H C H C H N H C O O H 2 2 A t h r a c e n B i p h e n y l A l k y l b e n z o l M a n d e l a t P h e n y l a l a n i n C O O H O H N a p h t l i n B e n z o a t B e n z o l P h e n o l C O O H O H C O O H H N O H O H N H 2 S a l i c y l a t B r e n z c a t e c h i n A n t h r a n i l a t T r y p t o p h a n P h e n a n t h r e n

Zu Protocatechuat führenden Abbauwege aromatischer Verbindungen 3 A l k y l C O O H C O O H C O O H C O H 3 Toluat Alkylphenol H O O H O O H O O H n 4-Hydroxy- benzoat Shikimat Lignin C O O H C O O H C O H C O H O H 3 C C O H 3 Protocatechuat Benzoat 3- Hydroxy-benzoat Vanillat

ortho-Spaltung des aromatischen Ringes Dioxygenase Brenzcatechin cis, cis- Muconat

(Catechol-2,3-Dioxygenase) Meta-Spaltung des aromatischen Ringes O H C Metapyrocatechase (Catechol-2,3-Dioxygenase) Brenzcatechin 2-Hydroxy- muconat- semialdehyd Protocatechuat- 4,5-Dioxygenase Protocatechuat 2-Hydroxy- 4-caroxymuconat- semialdehyd

Ortho-Spaltung des aromatischen Ringes und 3-Oxoadipat-Weg ~ S o A CO2 Brenz- catechin cis,cis- Muconat Mucono- lacton 4-Oxoadipat- enollacton Proto- catechuat 3-Carboxy- cis,cis-muconat 4-Carboxy- muconolacton 3-Oxoadipat 3-Oxoadipyl- CoA Succinat Acetyl~CoA Succinyl~CoA 4 1 5 2 6 3 1. Pyrocatechase 2. Muconat-Cycloisomerase 3. Muconolacton-Isomerase 4. Protocatechuat-3,4-Dioxygenase 5. 3-Carboxymuconat- Cycloisomerase 6. 4-Carboxymuconolacton- Decarboxylase 7. 4-Oxyoadipatenollacton-Hydrolase 8. 3-Oxoadipat-Succinyl-CoA-Transferase 9. 3-Oxoadipyl-CoA-Thiolase 7 8 9

cis - o - Hydroxybenzal- Proposed pathway for the degradation of naphthalene H O H O O2 O H C O2 2H+ + 2e- 2H+ + 2e- Naphthalene cis – Naphthalene dihydrodiol 1,2 - Dihydroxynaphthalene O H C O H H2O C O H O O H C O H CH3COCOOH Salicylaldehyde cis - o - Hydroxybenzal- pyruvic acid O H C RING FISSION P fluorescens Gentisic acid O H C O H RING FISSION Salicylic acid Catechol