SELDI-TOF Function and Reproducability Von Gerrit Erdmann Betreuer: Benedict Brors 15.06 2005
Was ist SELDI-TOF ? SLEDI-TOF: S urface E nhanced L aser D esorption/I onisation T ime o f F ilght Form der Massenspektroskopie Weiterentwicklung von MALDI-TOF Patent bei Ciphergen®
Wie Funktioniert SELDI-TOF Abb.1 In NO-Laser gibt einen kurzen Laserpuls auf den Chip ab Proteine desorbiert und wird ionisiert während Matrix die Energie absorbiert Beschleunigung über E-Feld und Auftrennung nach Masse/Ladung (m/z) Quotient
Wie Funktioniert SELDI-TOF Proteinchips mit verschiedenen vorbehandelten Oberflächen Ermöglicht es bestimmt Proteine anzureichern Abb.4 Abb.3 Abb.2
Einsatzgebiete von SELDI-TOF Abb.5
Einsatzgebiete von SELDI-TOF Biomarker Discovery Expression Difference Mapping TM Interaction Difference Mapping TM Antibody-Antigen Interaction DNA Protein Interaction Protein Purification Glycosylation Analyses uvm.
Beispiel eines SELDI-TOF Experiments Untersuchung von Eierstockkrebs durchgeführt 2002 von Petricoin et al. „black box aproach“ 3 Messreihen insgesamt, 2 aber später 216 Serum Proben: 50 normal , 50 Krebs als Trainingsdaten. 116 verdeckte Proben (50 normal , 50 Krebs, 16 benigne) mit Ciphergen H4 Proteinchip, baseline-subtraction“ Die Proben von 1. aber mit einem WCX2 Proteinchip, baseline-subtraction Neue Proben. 91 normal 162 Krebs. Auftrennung in Trainingsdaten nicht angegeben
Die Durchführung Massen Auflösung ständig überprüft Genauigkeit 0,1% 0-20000 Da als Zielgröße Positiv und Kontrollproben gleichzeitig, vermischt auf einem und mehreren Chips Serum von einer Normalprobe auf 100 verschieden Chips 9 davon zufällig für „Coefficient of Variance“ (CV) benutzt ( 8 Proteinpeaks)
Die Auswertung Normalisierung der Daten [0,1] 15 200 M/Z Werte mit einem Genetischen Algorithmus und Cluster Analyse untersucht Fitness Test ergibt Satz an „features“ der Trainigsdaten am besten trennt Anwendung auf die Verdeckten Daten mit 3 Kategorien „baseline-subtraction“ vermutlich erst nach Auswertung
Das Ergebnis für Messreihe 1 CV < 10% 63/66 der verdeckten Kontrollen (95%) richtig als nicht Krebs 16/16 benigne erkannt 50/50 als Krebs erkannt (auch Stage I) 100 % Sensitivität und 95 % Spezifität „positiv predictiv value“ 94 %
Überprüfung duch Baggerly 2004 Rohdaten nur für Messreihe 3 verfügbar, Messreihe 1 und 2 nur „baseline-substracted“ ( irreversibel, nichtlinear) Resultate nur für Messreihe 3 reproduzierbar
Ein Wechsel im Protokoll ? In Messreihe 1, Erkennung aller 16 benignen wegen deutlicher Unterschiede In Messreihe 2 kein deutlichen Unterschiede wegen Ähnlichkeit der zwischen 1 u. 2 vermutlich Protokollwechsel
Daten „offset“ und Übertragung auf Messreihe 3 Abweichung bei M/Z Value von ca. 1% zwischen 2 und 3 Versuch der Korrektur „feature“ Sätze von 2 funktionierten nicht für 3 Ungekehrt sehr schwierig ; Hinweise auf Signalsättigung Abb.6
Fazit Perfekte Seperation von 3 möglich , aber im „Noise-bereich“, z.T. auch bei 1 und 2 sehr seltsam da kein biologischer Hintergrund Unterscheide in Vorbereitung der Proben Keine Generalisierung der „feature“ Sets z.T. Set nicht stabil genug für „baseline-substraction“ Massenkalibrierung unzureichend bei 3 Werkseinstellungen Protokollwechsel in Messreihe 1 Struktur Erkennung theoretisch möglich, Ergebnisse aber vermutlich nicht Verwertbar, gewisse „baseline-subtraction“ sinnvoll
Ausblick Verbesserung der Vergleichbarkeit auch zischen verschiedenen Studien vollautomatische, robotisierte Flüssigkeitshandhabung Verbesserung der des CV von ca. 45 % auf ca. 27% Einführung von „replicates“ Auswahl der Peaks SNR ≥ 1,25: CV 53,3 % SNR ≥ 2 : CV 26,4 % Einführung und kontinuierliche Überprüfung von standardisierten Versuchparametern Z.B.Trocknungszeitunterschiede von mehr als 25 min vor der Zugabe der Matrixmoleküle kann zu CVs von bis 67 % führen
Abbildungs- und Literaturverzeichnis Abbildungensverzeihnis Abb.1: http://arthritis-research.com/content/figures/ar1723-1.jpg Abb.2: http://www.proteomicsnijmegen.nl/Seldi_pages/possibilities.htm Abb.3: http://www.genetics.med.ed.ac.uk/cysfib/seldipix/pipette.jpg Abb.4: http://www.mrlaser.com/Reduced%20Size%20Photos/Ciphergen%20Array.JPG Abb.5: K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-785 Literaturverzeichnis K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, 777-785 E. Petricoin et al. (2002) Use of Proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer The Lancet, 359, 572-577 M. Aviado et al. (2005) Optimization and evaluation of surface-enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS) with reversed-phase protein arrays for protein profiling Clin Chem Med 43(2) 133-140 http://www.ciphergen.com/