Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von Proteinen von Tim Grotjohann Veranstalter Lehrstuhl für Genetik Universität Bielefeld

Inhaltsübersicht: Allgemeines zum Protein-Blot Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese Blottingmembranen Gel-Blot 1) Wet-Blot 2) Semi-Dry-Blot 3) Transferpuffer Dot-Blot Färbeverfahren für transferierte Proteine

Allgemeines zum Protein-Blot Definition: beim Protein-Bloting werden Proteine auf eine Membran übertragen und dort einer spezifischen Nachweisreaktion unterzogen DOT-Blot: Proteine werden direkt auf die Membran getüpfelt Gel-Blot: Übertragung von Proteinen, die zuvor in einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt wurden die Membran: sie dient als Trägermatrix für die Proteine, auf der diese immobilisiert sind und sich somit leichter handhaben lassen Western-/Immuno-Blotting: mittels einer spezifischen Antikörperreaktion lassen sich hiermit bestimmte Proteine identifizieren, die Molmassen dieser bestimmen oder auch die Spezifität eines Antikörpers bestimmen es gibt noch weitere Verfahren, bei denen die Fähigkeit von Proteine ausgenutzt wird, an andere Moleküle zu binden (North-Western-Blotting, South-Western-Blotting, Virus-Overlay,…)

Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese Proteinaufreinigung: durch Degradierung von Proteinen können weitere Banden auf dem Gel entstehen – so kann es beim Kochen der Probe in SDS- und alkanolaminhaltigem Probenauftragspuffer zur Fragmentierung von Proteinen kommen  deswegen wird eine Erhitzung auf lediglich 60°C für ca. 10-30 Minuten empfohlen Gelelektrophorese: Je dünner das Gel, desto effizienter ist der Transfer – deshalb sollten Gele eine Dicke von 2mm möglichst nicht überschreiten

Blottingmembranen Nylon: hohe Proteinbindekapazität besonders für das Blotten von sauren Proteinen oder bei Chemoluminiszenznachweisen benötigt spezielle Blockingreagenzien (Casein und Polyvinylpyrrolidon) Polyvinylidenfluorid (PVDF): hohe Proteinbindekapazität (bis 600µg/cm²) gute Resistenz gegen organische Lösungsmittel gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis bei Chemolumineszenz-Detektionssystemen

Bindekapazität von 180µg/cm² kleine Porengröße von 0,025µm Blottingmembranen Nitrocellulose (NC): Bindekapazität von 180µg/cm² kleine Porengröße von 0,025µm günstiger als PVDF beim Dot-Blot vorwiegend verwendet, da diese Membran eine hohe Saugfähigkeit hat

Gel-Blot Der Transfer muss direkt nach der Auftrennung der Proteine erfolgen Transfer-Methoden: Diffusions- und Vakuumtransfer finden eher bei der Arbeit mit nativen Gelen ihre Verwendung Als Standardverfahren hat sich der elektrophoretische Transfer durchgesetzt  im Folgenden werden exemplarisch die elektrophoretischen Verfahren „Wet-Blot“ uns „Semi-Dry-Blot“ vorgestellt

Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen Gel-Blot Vorteile des Semi-Dry-Blots sind die höhere Transfergeschwindigkeit und die sehr viel geringere Menge an verwendetem Transferpuffer Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen Wet-/Tank-Blot Semi-Dry-Blot

1) Wet-Blot Gel-Blot – 1)Wet-Blot + - Gel Membran Schwammtuch Kunstoffgitter Filterpapier

2) Semi-Dry-Blot 2kg - Gel Filterpapier Membran +

3) Transferpuffer grundsätzlich gibt es mehrere Alternativen Er darf keine stark leitenden Salze enthalten, da diese zu hohen Strömen führen, was einen schlechten Transfer und eine Überhitzung der Apparatur zur Folge hat der Puffer muss keinen exakten pH-Wert aufweisen (alle Werte zwischen 7,3 und 11 sind akzeptabel) Er enthält 0- 20% Methanol, welches die Membran benetzt und so die Proteinbindung erleichtert, sowie die SDS-Bindungen lockert

Dot-Blot Hierbei wird auf die gelelektrophoretische Trennung verzichtet und die Proteine direkt auf die Membran getüpfelt Hauptanwendungsgebiete: -immunchemische Quantifizierung kleinster Proteinmengen -Detektion bestimmter Proteine aus einem Proteingemisch -Bestimmung von Nachweisgrenzen von Detektionssystemen -bei Verwendung von Proteinen mit sehr hoher/kleiner Molmasse, oder solchen, die durch die Elektrophorese beschädigt würden, oder durch ihre hohe Ionenstärke die Trennung stören würden nur dann anwendbar, wenn monoklonale Antikörper oder Proben mit nur einem Protein verwendet werden

Färbeverfahren für transferierte Proteine Die Effizienz eines Blotvorgangs lässt sich mit unspezifischen Proteinfärbemethoden bestimmen: Ponceau-S-Färbung: geeignet für NC und PVDF Nachweisgrenze bei 5-15ng Protein/mm² kolloidales Gold: Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² benötigt abgesättigte Membran neigt zu irreversiblen Bindungen

Färbeverfahren für transferierte Proteine -Fluorophore: -geeignet für NC und PVDF -Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm² -benötigt aufwändige optische Ausrüstung -Direktblau 71: -Nachweisgrenze bei 0,5-1,5ng Protein/mm² (NC) bzw. 1-3ng Protein/mm² (PVDF) -hohe Kontrast