Wieviel Modellierung braucht ein Biologie? Dr. Peter Friedhoff Institut für Biochemie, Fachbereich Chemie und Biologie Justus-Liebig-Universität Gießen Vielen Dank für freundliche Einführung Herr Dekan. Sehr geehrte Damen und Herren, ich begrüße Sie ganz herzlich zu meinem (Habilitationsvortrag) mit dem Thema „Wieviel Enzymologie braucht ein Systembiologe?“ Bei der Auswahl möglicher Themen für diesen Vortrag erscheint der vom Habilitationsgremium gewählte Titel im nachhinein als sehr komplex. Ich kann daher in der mir zur Verfügung stehenden Zeit nur auf einige Aspekte dieser Frage eingehen. Ähnlich schwierig zu beantworten erscheint die Frage, wieviel Quantenphysik braucht ein Chemiker. Wie vielen von mir in der Zwischenzeit befragten Kollegen geht es wahrscheinlich auch einigen von Ihnen. Was ist eigentlich Systembiologie?

Systembiologie? Ich werde daher in meinem Vortrag zunächst einige Definitionen für den Begriff Systembiologie geben, und Sie werden feststellen, dass aus den zum Teil sehr unterschiedlichen Definitionen die Beantwortung der Frage „Wieviel Enzymologie braucht ein Systembiologe?“ sehr unterschiedlich zu beantworten ist. The Scientist (2003),17:26

Was ist der Unterschied zwischen einer lebenden und einer toten Katze? Eine Antwort ist „Systembiologie“: „A dead cat is a collection of its component parts. A live cat is the emergent behaviour of the system incorporating those parts.“ Vielleicht erklärt ja folgende Frage, die kürzlich in einem Editorial von Nature die Tierfreunde weltweit betroffen machte: „Was ist der Unterschied zwischen einer lebenden und einer toten Katze?“ Systembiologie. Während eine tote Katze nur die Ansammlung ihrer Komponenten darstellt, ist die lebenden Katze, das sich herausbildende Verhalten eines Systems, das diese Komponenten enthält. Die Idee der Systembiologie ist allerdings nicht neu. Warum sie in der postgenomischen Ära wieder an Bedeutung gewinnt, dazu später mehr. Zunächst ein kleiner historischer Rückblick: Editorial Nature (2005), 341: 1

Biologische Systeme Organismus Organ Gewebe Zelle Organell … Bevor ich mich dem Begriff Systembiologie weiter zuwende, werde kurz etwas über biologische Systeme sagen. Wir fangen hier willkürlich auf der Ebene der Organismen an, ohne jedoch zu vergessen, das es höhere Organisationsstufen (Systeme) gibt. Im Zeitalter von Omics spricht man dann z.B. von Meta-Genomics. Von dieser Stufe kann man sich suksesszive immer weiter nach unten bewegen. Eine einzelne Zelle macht zwar noch keinen Menschen [aus] aber kann, unter geeigneten Umständen zu einem Menschen werden. Systeme werden von Komponenten und deren Interaktionen miteinander gebildet. Das System hat Eigenschaften, die über die Summe der Eigenschaften seiner Komponenten hinausgehen. Deshalb sagt man auch, dass Systeme bei ihrer Analyse nicht auf die Komponenten reduziert werden können, um die Eigenschaften des Systems zu verstehen. Man spricht von komplexen Systemen, wenn man deren Verhalten nur schwer oder gar nicht vorsagen kann. Voet & Voet (2004) Biochemistry 3.Ed.

Schlüsseleigenschaften von Systemen Systemstrukturen Bestandteile biologischer Systeme sowie deren strukturelle Beziehungen Systemdynamik Verhalten des System unter verschiedenen externen und internen Bedingungen Systemkontrolle Mechanismen, die das System unter Kontrolle halten Konstruktionsprinzipien Diese müssen in biologischer Systeme identifiziert und bei der Systemanalyse und der Erzeugung von gewünschten Eigenschaften genutzt werden. Ein System setzt sich aus Komponenten sowie deren Beziehungen zueinander zusammen. Weiterhin ist für das System wichtig, wie es sich unter dem Einfluß verschiedener externer und interner Parameter verhält. Ein ganz wichtiger Faktor sind dabei Kontrollmechanismen, die dem System Robustheit verleihen. Bei der Analyse von Systemen ist man nicht zuletzt an den Konstruktionsprinzipien interessiert. Welche Komponenten und Prozesse gibt es, welche sind essentiell, welchen lassen sich durch anderen Prozesse ersetzten etc. Alles dies braucht man, wen man irgendwann einmal Systeme nicht nur verstehen, sondern auch verändern will. (Jeder dumme Junge kann einen Käfer zertreten. Aber alle Professoren der Welt können keinen herstellen.) Nocht nicht, sagen manche. Ein Beispiel: Wenn man ein Gen entfernt, welchen Phänotyp ergibt dies? Wenn es keinen Phänotyp gibt, heisst dies nur, dass diese Gen unter den „Laborbedingungen“ nicht essentiell ist. Es sagt allerdings nichts darüber aus, wie sich das System verhält, wenn sich die Rahmenbedingungen ändern. http://www.bmbf.de/pub/systembiologie.pdf

Systembiologie "Systembiologie untersucht das Verhalten und die Wechselwirkungen aller Elemente in einem bestimmten funktionierenden biologischen System“ Ideker, T.; Galitski, T.; Hood, L. (2001) Annu. Rev. Genomics Hum.Genet. 2 Palsson, B. (2000) Nature Biotechnology 18, 1147-1150 "Systembiologie untersucht das Verhalten und die Wechselwirkungen aller Elemente in einem bestimmten funktionierenden biologischen System Durch neue experimentelle Methoden erscheint es daher nun möglich, statt „ein Protein nach dem anderen zu analysieren“ global, viele Parameter eines Systems gleichzeitig zu erfassen und damit den Zustand des Systems zu beschreiben. Diese Daten bilden die Grundlage bzw. sind Größen an denen sich Modelle, die das System beschreiben messen müssen. http://www.bmbf.de/pub/systembiologie.pdf

Was ist nun Systembiologie? Pragmatische Systembiologen: Ausnutzung der Technologien zur systematischen Genom-, Proteom- und Metabolomanalyse für die Erzeugung von Modellen komplexer biologischer Systeme und Krankheiten Ideker (2004) Nature Biotechnology 22 473-475 Systemtheoretische Biologen: „[...] Systembiologie [ist] interdisziplinäre Forschung, die (Zell-) Biologie und Systemtheorie kombiniert“ „die Anwendung von Systemtheorie auf die Genomforschung“ Wolkenhauer (2001) Briefings in Bioinformatics, 2:258-270 Was ist nun Systembiologie ? Das hängt davon ab, wen man fragt. Grundsätzlich gibt es zwei verschiedene Richtungen: Die pragmatischen Systembiologen, die wie schon erwähnt die neuen Technologien ausnutzen bzw. entwickeln, um ganze Systeme zu erfassen und die Systemtheoretischen Biologen, die die Systemtheorie in der Vordergrund stellen, allerdings nicht ohne auch Modelle und Experimente zu machen. Nicht das an dieser Stelle der Eindruck geweckt wird, dass systemtheoretische Biologie nur eine theoretische Biologie ist… Folgt man nun den pragmatischen Systembiologen, so erhält man oft folgende Aussagen:

Pragmatische Systembiologie „Ausnutzung der Technologien zur systematischen Genom-, Proteom- und Metabolomanalyse für die Erzeugung von Modellen komplexer biologischer Systeme und Krankheiten“ Ideker (2004) Nature Biotechnology 22 473-475 Leroy Hood:Mitgründer des Institute for Systems Biology, Seattle Systembiologie sollte: hypothesengetrieben so global wie möglich (z.B. Genomics, Proteomic etc.) quantitativ!!! integrativ (verschiedene Detailstufen von Daten und Modellen) iterative Vorgehensweise dynamisch Laute Leroy Hood, einem Pionier der Genomforschung und Mitbegründer des Institutes for Systems Biology in Seattle sollte die Systembiologie Hypothesengetrieben so global wie möglich (z.B. Genomics, Proteomic etc.) quantitativ!!! integrativ (verschiedene Detailstufen von Daten und Modellen) iterative Vorgehensweise Und dynamisch sein http://www.sysbio.de/

Hypothesen-getriebene Forschung in der Systembiologie Hypothesen-getriebenen Forschung in der Systembiologie beginnt mit der Auswahl von Fragen von “biologischer” Signifikanz und der Erzeugung eines Models zur Beschreibung des Phänomens. Diese Modelle werden entweder automatisch erzeugt (aus den Daten heraus) bzw. manuell erstellt. Das Modell stellt nun eine “berechenbare” Menge von Annahmen und Hypothesen dar, die experimentell überprüfbar sind bzw. Sein sollten. Die Modelle können nun zunächst durch Simulation mit vorhanden experimentellen Daten auf Konsistenz überprüft werden und gegenenfalls revidiert bzw. verworfen werden. Dann werden einige testbare Vorhersagen auf der Basis des Modells erstellt und hiermit “sinnvolle” Laborexperimente geplant und durchgeführt. Die neuen Daten werden nun benutzt um das Modell zu “verifizieren” bzw. Neue veränderte Modelle zu entwerfen. Was für Experimente werden dabei durchgeführt? Fig. 1. Hypothesis-driven research in systems biology. A cycle of research begins with the selection of contradictory issues of biological significance and the creation of a model representing the phenomenon. Models can be created either automatically or manually. The model represents a computable set of assumptions and hypotheses that need to be tested or supported experimentally. Computational „dry“ experiments, such as simulation, on models reveal computational adequacy of the assumptions and hypotheses embedded in each model. Inadequate models would expose inconsistencies with established experimental facts, and thus need to be rejected or modified. Models that pass this test become subjects of a thorough system analysis where a number of predictions may be made. A set of predictions that can distinguish a correct model among competing models is selected for „wet“ experiments. Successful experiments are those that eliminate inadequate models. Models that survive this cycle are deemed to be consistent with existing experimental evidence. While this is an idealized process of systems biology research, the hope is that advancement of research in computational science, analytical methods, technologies for measurements, and genomics will gradually transform biological research to Þt this cycle for a more systematic and hypothesis-driven science. Kitano (2002), Science 295 1662-1664

Systeme analysieren – Bottom-up, top-down, oder middle-out? Top-down: Fängt bei höheren Detailstufen an und arbeitet sich zu niedrigeren Stufen vor Bottom-up: von den Komponenten (DNA, Protein) zu den übergeordneten Systemen bis hin zum Organismus (oder höheren Stufen) Beide Ansätze werden verwendet, sind gültig und ergänzen sich gegenseitig

Prozesse in der Systembiologie Datengewinnung Hochdurchsatzverfahren/Parallelisierung Quantitative Methoden Qualität/Standardisierung Datenbanken Modellierung Chemisch-kinetische Modelle Diskrete Schaltkreismodelle …

Technologien zur Datengewinnung Institute for Systems Biology, Seattle, USA Gene (DNA) DNA-Sequenzierung, Genotypisierung, Gen-Deletion, RNAi-knockouts Genexpressionsmuster (RNA) Microarrays und DNA tagging Verfahren DNA-Protein-Interaktionen Chromatin-Immunoprezipitation und Gen- Chips (ChIP-Chip) Protein-Protein Interaktionen Two-hybrid-basierte Interaktionen, Affinitätsaufreinigung/Massen- spektrometrie, quantitative Proteomanalyse Subzelluläre Protein Lokalisation Zellsortierung, molecular imaging von Reportergenen, Antikörperfärbung Probing genetic frameworks: What is the genomic parts list of an organism? What genes interact in concert to regulate or create a molecular interaction network? How does genetic variation influence gene expression and protein function? Representative technologies: DNA sequencing, genotyping, large-scale gene deletion constructs; RNAi knockouts Probing gene expression patterns: What genes are up-regulated or down-regulated in response to a genetic or environmental perturbation? What genes are expressed in what tissues under what conditions? Representative technologies: microarrays and DNA tagging procedures Probing DNA-protein interactions: What genes does a particular transcription factor regulate under defined experimental conditions? Representative technology: chromatin-immunoprecipitation and gene chips to localize binding sites (ChIP-chip) Probing protein-protein interactions: What proteins are present in enzyme complexes, nuclear pore complexes, the cytoskeleton? Which proteins modify other proteins in signaling cascades? Representative technologies: two-hybrid-based interactions; affinity purification; mass spectrometry; quantitative proteomics Probing subcellular protein localization: When during development is a protein made and where in the cell does it go? Representative technologies: cell sorting, molecular imaging based on reporter genes or antibody staining

In der Praxis sieht das dann so aus: Galaktose-Stoffwechsel in Hefe Datenerfassung und Prozessierung Hwang, Daehee et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 17302-17307

In der Praxis sieht das dann so aus: Galaktose-Stoffwechsel in Hefe Modell des Netzwerkes Hwang, Daehee et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 17302-17307

Strukturen, Dynamik und Kontrolle: E. coli Metabolismus Massentransfer Enzyme +Regulation Metabolite Kommen wir nun einen Schritt näher zu der Frage, wozu könnte man als Systembiologie die Enzymologie brauchen. Als Beispiel habe ich hierzu den Metabolismus von E. coli gewählt. Dies ist die * Quelle: EcoCYC

“Biology needs to graduate from the cartoon diagram” Bruce Alberts, ehemaliger Präsident der US National Academy of Sciences in einer Bemerkung auf einem Symposium mit Thema “Dynamics in Biological Networks” in Princeton 2001 http://www.wtec.org/sysbio/host_presentations/europe/UK%20trip%20files/Oxford-DN/Dept%20of%20Physiology/DN-MF.doc

Vom Cartoon zum Modell: quantitative Modellierung Massentransfer Enzyme +Regulation Metabolite * Quelle: EcoCYC

Quantitative Modelle Empirische Modelle Regression Beschreiben die Form der Daten Parameter korrespondieren nicht unbedingt mit biologischer/physikalischer Größe Regression Nicht-lineare Modellierung Neuronale Netze Blutdruck Log (Dosis) Beschreiben die Form der Daten; passen sich gut an die Daten an Parameter korrespondieren nicht unbedingt mit biologischer oder physikalischer Größe Gründe für abstrakte Modelle Zu wenig Daten Mechanistisches Modell ist zu komplex Rechenzeit Verständnis

Quantitative Modelle Physikalisch/Mechanistisch Aufzählung der Komponenten, Beziehungen und physikalische Beschreibung der Interaktionen Deterministisch oder stochastisch Beschreiben die Form der Daten; passen sich gut an die Daten an Parameter korrespondieren nicht unbedingt mit biologischer oder physikalischer Größe

Beispiele für komplexe Systeme E. coli Metabolismus Massentransfer Enzyme +Regulation Metabolite * Quelle: EcoCYC

Einfaches Modell mit Rückkopplung MAP Kinase Kinase Kinase MAP Kinase Kinase In cell biology, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) (EC 2.7.1.37) are serine/threonine-specific protein kinases that respond to extracellular stimuli (mitogens) and regulate various cellular activities, such as gene expression, mitosis, differentiation, and cell survival/apoptosis. MAP Kinase Mitogen-aktivierte Kinase www.celldesigner.org

Simulation ohne Feedback Konzentration Zeit

Simulation mit Feedback Konzentration ein oszillierendes System Zeit

Simulation mit Feedback Was passiert, wenn … Konzentration Dephosphorylierung durch Phosphatase Zeit Die Aktivität der Phosphatase um 50 % reduziert wird

Simulation mit Feedback Was passiert, wenn … Konzentration Dephosphorylierung durch Phosphatase Zeit Reduktion der Phosphataseaktivität um 50 %  Frequenzmodulation des Oszillator

Vorgehensweise bei der Modellierung hier: kinetische Modelle Verhalten des Modells unter verschiedenen Bedingungen (Parametern, Konzentrationen) (Simulation) Schlüsselparameter erkennen (Systemanalyse) Vergleich mit experimentellen Daten (z.B. Proteinkonzentration, Input/Output, Metabolitkonzentrationen) (Experiment) Vergleich der Parameter in der Simulation mit denen aus Experimenten Modell verfeinern (Iteration)

Kinetische Modelle in der Signaltransduktion Input Input EGF epidermal growth factor  transiente Stimulation NGF nerve growth factor  transiente und anhaltende Stimulation ERK extracellular-signal-regulated kinase Zelle reagiert mit Wachstum oder Differenzierung PC12 cells Output Sasagawa et al. Nat Cell Biol. 2005 Apr;7(4):365-73

Vergleich von Simulation (in silico) und Experiment (in vivo) EGF NGF Simulation Simulation Output Stepwise increases of EGF and to stepwise decreases of NGF. (a) The indicated The solid red line indicates the stepwise increases in EGF stimulus (0.5–10 ng ml–1). The dashed blue and green lines indicate 0.5 and 10 ng ml–1 of constant EGF stimuli, respectively. (b) The indicated stepwise decrease of nerve growth factor (NGF) or constant NGF stimulus (inset) was The solid blue and cyan lines indicate the stepwise decreases of NGF stimuli (5–1 ng ml–1 and 5–0 ng ml–1, respectively). The dashed blue and cyan lines indicate 5 and 1 ng ml–1 of constant NGF stimuli, respectively. In vivo Daten In vivo Daten Sasagawa et al. Nat Cell Biol. 2005 Apr;7(4):365-73

Verschiedene Ebenen – Verschiedene Modellierungen The different levels of description in models of genetic networks.Whereas single genes can be modeled in molecular detail with stochastic simulations (left column), a differential equation representation of gene dynamics is more practical when turning to circuits of genes (center left column).Approximating gene dynamics by switchlike ON/OFF behavior allows modeling of mid-sized genetic circuits (center right column) and still faithfully represents the overall dynamics of the biological system. Large genetic networks are currently out of reach for predictive simulations. However,more simplified dynamics, such as percolating flows across a network structure, can teach us about the functional structure of a large network (right column). Bornhold (2005), Science 310 449-450

„All models are wrong. Some models are useful.“ George Box

Nun fängt die Arbeit an ...

In vivo Kinetiken der Nukleotid-Exzisions-Reparatur Friedberg, Nature Reviews Cancer 1, 22-33 (2001)

In vivo Kinetiken der Nukleotid-Exzisions-Reparatur Fluoreszenz-markiertes XPC UV-Schaden setzen Kinetiken verfolgen Politi et al. (2005) Molecular Cell, 19, 679–690

Glykolyse in Erythrocyten - Modell Daten gemessen simuliert Mulquiney & Kuchel (1999) Biochem J. 3:581-96

Systembiologie – Eigentlich nichts Neues? Walter Cannon (1932): Konzept der „Homeostase“ Norbert Wiener (1948): Kybernetik Ludwig von Bertalanffy (1968): Allgemeine Systemtheorie Systembiologie, bzw. Definitionen, die denen für Systembiologie ähneln sind seit langem bekannt: Walter Cannon hatte bereits 1932 das Konzept der Homeostase vorgestellt, das offene Systeme, wie unser Körper, ihr Inneres stabil konstant zu halten. Unter anderem von Norbert Wiener wurde der Begriff Kybernetik geprägt, die Wissenschaft von der Struktur komplexer Systeme, insbesondere der Kommunikation und Steuerung einer Rückkopplung bzw. eines Regelkreises Ludwig von Bertalanffy führt den Begriff der allgemeinen Systemtheorie ein. Systemtheorie studiert das Verhalten von Systemen als Ganzes. Was ist daher neu an dem Begriff Systembiologie bzw. wieso finden wir diesen Begriff immer häufiger in der (naturwissenschaftlichen) Literatur? (1092 Eintragungen in PUBMED; allein 821 in den letzen 2 Jahren; 1067 in den letzen 5 Jahren) Cannon based this proposition on insights into the ways by which steady states such as glucose concentrations, body temperature, and acid-base balance were regulated. Cybernetics is the study of the communication and control of regulatory feedback, both in living beings and machines, and in combinations of the two. The term cybernetics stems from the Greek Κυβερνήτης (kybernetes - meaning steersman, governor, pilot, or rudder; the same root as government). It became a powerful vogue idea from 1948 to the 1960s; but since the 1970s use of the term has faded. A current near-synonym is systems theory. Steady-state conditions require that any tendency toward change automatically meets with factors that resist change. An increase in blood sugar results in thirst as the body attempts to dilute the concentration of sugar in the extracellular fluid. The regulating system that determines the homeostatic state consists of a number of cooperating mechanisms acting simultaneously or successively. Blood sugar is regulated by insulin, glucagons, and other hormones that control i Homeostasis is the property of an open system, especially living organisms, to regulate its internal environment to maintain a stable, constant condition, by means of multiple dynamic equilibrium adjustments, controlled by interrelated regulation mechanisms. The term was coined in 1932 by Walter Cannon from the Greek homo (same, like) and sta (to stand or stay). ts release from the liver or its uptake by the tissues. Homeostasis does not occur by chance, but is the result of organized self-governmen Systems theory is an interdisciplinary field which studies relationships of systems as a whole. Modern systems theory was founded by Ludwig von Bertalanffy, William Ross Ashby and others between the 1940s and the 1970s on principles from philosophy, physics, biology and engineering and later grew into numerous fields including philosophy, sociology, organizational theory, management, psychotherapy (within family systems therapy) and economics among others. Cybernetics is a closely related field. In recent times systems science, systemics and complex systems has been used as a synonym.

Probleme mit experimenteleln enzymatischen Konstanten Daten aus der Literatur Allerdings: Messungen erfolgen oft unter sehr verschiedenen Bedingungen (pH, Temperatur, Ionenstärke etc.) Oft fehlen wichtige Details der Assay-Bedingungen Oft fehlende statistische Auswertung Probleme beim Vergleich der Konstanten von Enzymen aus unterschiedlichen Spezies Ungenaue/Fehlerhafte Konstanten können enormen Einfluss auf Simulation in Modellen haben

BRENDA BRaunschweiger ENzyme DAtabase

Bessere Daten: STRENDA Standard Requirements for Reporting Enzyme Activity Data Apweiler et al. (2005) TRENDS in Biochemical Sciences 30:10-11 http://www.strenda.org/

Modellierung einfacher Systeme 50 % v X0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 X1 Was passiert mit dem steady state? X0 und X1 sind konstant, Alle Reaktionen reversibel, Annahme stabiler Steady state

Modellierung einfacher Systeme 50 % v X0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 X1 Steady-state Steady-state Konzentration Zeit Zeit

Modellierung einfacher Systeme 50 % v X0 S1 S2 S3 S4 S5 S6 X1 Wenn man dieses System versteht, was ist mit diesem?

Prozesse in der Systembiologie Datengewinnung Hochdurchsatzverfahren/Parallelisierung Quantitative Methoden Qualität/Standardisierung Datenbanken Modellierung Chemisch-kinetische Modelle Diskrete Schaltkreismodelle