Nobumichi Hozumi Susumu Tonegawa Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions Nobumichi Hozumi Susumu Tonegawa Von Helen Haukamp 28.2.2011

Inhalt Susumu Tonegawa Wissensstand 1976 Experimente zur Klärung der Entstehung der Antikörper-Diversität Ergebnisse Diskussion Offene Fragen Heutiger Wissensstand Die Schlüsselergebnisse Quellen

Susumu Tonegawa Susumu Tonegawa bekam 1987 den Nobelpreis in Physiologie/Medizin  Entdeckung des genetischen Prinzips für die Generierung der Antikörper-Diversität Quelle: http://www.brain.riken.jp/bsi-news/bsinews37/files/s_tonegawa.jpg

Was war 1976 bekannt? Antikörper bestehen aus zwei verbundenen Regionen  variable Region und konstante Region Große Antikörper-Diversität es gibt mehrere Gene führ die variable Region in der Keimbahn genaue Anzahl der Gene nicht bekannt, wahrscheinlich einige Gene für die konstante Region (C-Gene) und viele Gene für die variable Region (V-Gene) Quelle: janeway V1 V2 V3 V4 C

Experimente zur Klärung der Entstehung der Antikörper-Diversität Verwendete DNA:  DNA von Balb/c Maus früher Embryo (Embryo DNA)  DNA aus MOPC 321 Plasmazytomzellen (Tumor DNA) Schritt 1: DNA-Verdau durch selbst aufgereinigte BamH I Restrictions Endonuklease

 Elektrophorese bei 4° für 3 Tage Schritt 2: Gießen eines 2 Liter Agarose Gels und Beladung mit je 5 mg DNA  Elektrophorese bei 4° für 3 Tage Schritt 3: Extraktion der DNA aus dem Agarose Gel Schritt 4: RNA-DNA Hybridisierung - mit MOPC 321 125I-markierter κ mRNA oder ihrem 3`-Ende (3`-Hälfte) - Resultierende Radioaktivität wurde gemessen

Ergebnisse

Hybridisierungsmuster der Embryo-DNA (Keimbahn-DNA) und der Tumor-DNA MOLECULAR WEIGHT (x10-6) Hybridisierte DNA und mRNA Moleküle weisen eine erhöhte Radioaktivität auf. CPM IN HYBRID Quelle: original Text MIGRATION (cm)

Ergebnis für die Embryo-DNA Zwei Fragmente zeigen Hybridisierung  1. Molekulargewicht: 6.0 (x10-6) Mr 3`-Ende 3`-Ende κ mRNA 3`-Hälfte κ mRNA (ganz)  2. Molekulargewicht: 3.9 (x10-6) Mr 5`-Ende κ mRNA (ganz)

Ergebnis die Tumor-DNA Ein Fragment zeigt Hybridisierung Molekulargewicht: 2.4 (x10-6) Mr 5` 3` 3´5´ κ mRNA (ganz) κ mRNA 3`-Hälfte V- und C-Gene sind in dem 2.4 (x10-6) Mr DNA Fragment enthalten

Diskussion Die Embryo-DNA enthält zwei Fragmente die nicht in der Tumor-DNA enthalten sind  V-Gen Fragment und C-Gen Fragment  Also liegen die V- und C-Gene in der Keimbahn DNA weit voneinander entfernt Die Tumor DNA enthält ein Fragment das nicht in der Embryo DNA enthalten ist  V-C-Gen Fragment Also liegen die V- und C-Gene in der differenzierten DNA nebeneinander und sind verbunden

Sie werden während der Reifung von Lymphozyten rekombiniert. Vκ- und Cκ-Gene sind in der Keimbahn nicht verbunden, sondern weit von einander entfernt. Sie werden während der Reifung von Lymphozyten rekombiniert. Quelle: original Text

Offene Fragen I Mechanismus der Rekombination Mögliche Rekombinations- Mechanismen von V-Genen und C- Genen: Copy-insertion Excision-insertion Deletion Inversion Quelle: original Text

Offene Fragen II B-Lymphozyten exprimieren nur ein V-Gen der leichten Kette  Wie wird ein bestimmtes V-Gen aktiviert? - mögliche Erklärung: Die Aktivierung ist eng gekoppelt mit dem Zusammentreffen mit einem C-Gen in einem B-Lymphozyten wird nur ein Allel exprimiert  gibt es also einen Allelausschluss? - mögliche Erklärung: ein Allel geht verloren, das andere wird verdoppelt

Heutiger Wissensstand Mechanismus der Rekombination Quelle: Konzepte Vorlesung Allelausschluss Ausgelöst durch Signal des B-Zell Rezeptors Der Zugang der Rekombinase Maschinerie zum Schwere-Kette Lokus wird verhindert

Die Schlüsselergebnisse Die Hybridisierungsmuster der Embryo- und der Tumor-DNA unterscheiden sich stark voneinander Die Embryo-DNA enthält weit voneinander entfernt liegende V- und C-Gene Die Tumor-DNA enthält nur ein V-C-Genesegment  Es findet eine Umlagerung der Gene während der Differenzierung der Lymphozyten statt

Quellen http://www.brain.riken.jp/bsi-news/bsinews37/files/s_tonegawa.jpg Janeway´s immuno biology Original Text: Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions Konzepte Vorlesung