V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05) Wie stark binden Liganden an Proteine? Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern? Wie gelangen Liganden zum Protein (elektrostatische Anziehung)? Wie gelangen sie ins Proteininnere bzw. wieder hinaus?

beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb) Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche. Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H-Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus. Benzolring passt optimal in hydro-phobe Tasche. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp) Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren. Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation. Wie gelangt Substrat hinein? www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp) Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei hypervariable Loops geformt. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Streptavidin:Biotin (1stp) Sehr polare, tiefe Bindungstasche. Außerordentlich starke Affinität. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr) Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen. Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen Aspartat-Residuen bilden. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Identifikation von funktionellen Residuen 1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch) konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur 2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren. Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig. Funktionalität auf Kosten von Stabilität. 3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur. Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.

Wo ist das aktive Zentrum I? Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien: - Auflösung  2.0 Å - funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE) - enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank) - die SCOP-Einträge sind unterschiedlich - es gibt  10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < 10-10. 98 katalytische Residuen: 22 His 17 Asp, Glu 10 Cys 8 Ser 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) 5 Tyr 3 Asn 2 Thr

Repräsentative Enzyme PDB Protein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der SCOP Seq. katalytischen Residuen

Repräsentative Enzyme

Fitness-Funktion - Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek - Seitenketten-Packung (wissensbasiert) - Hydratation (wissensbasiert) Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen Residuen - elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen  elektrostatisches Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung) Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue. native Hydratations- lokale D52 hat sehr schlechten Rang. D.h. Residue klasse Struktur es wäre günstig D52 zu ersetzen. Katalytische Residuen sind stets un- stabiler als nicht-katalytische. Score Rang Score native native beste Residue Residue Residue Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Flussdiagramm der Vorhersagemethode. - Links oben Analyse der Konservierung. - Rechts oben Analyse der Position in 3D-Struktur bzw. Stabilität der Mutantenproteine - untere Hälfte trifft für verschiedene Aminosäuretypen (1-Letter-code) die Entscheidung, ob katalytische Residuen vorliegen. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen katalytischen Residuen sind markiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

Wo ist das aktive Zentrum II Analyse mit elektrostatischen Kontinuumsrechnungen Die Titrationszustände der meisten Aminosäuren folgen der Henderson-Hasselbalch-Gleichung. Berechne Titrationskurven für 3 Enzyme mit UHBD. TIM und AR haben eine sehr ähnliche Strukturen, katalysieren aber ganz unterschiedliche Reaktionen. AR und PMI haben sehr verschiedene Strukturen, katalysieren aber ähnliche Reaktionen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller His-Residuen in TIM Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His95, Glu165, Lys112, Tyr164. Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller Tyr-Residuen in AR Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von Aldose zu einem Alkohol. Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209. Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen liegen in der Nähe.

Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller Lys-Residuen in PMI Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6- Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His135, Lys100, Lys136, Tyr287. Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135 nahe bei Lys136.

albumin Enzymfunktion Weitere Beispiele PDB ID Name Chemie Residuen mit auffälligen Titrationskurven 1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase* Transamination [Y256], [Y295], [H301] 1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease) 1EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425] 1HKA 6-Hydroxymethyl-* Kinase [D97, H115] 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase 1OPY 3-Keto-5-Steroid Isomerase [Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase 1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96] 1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease) 1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albumin Enzymfunktion Residue im zweiter Schale. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) Residue im aktiven Zentrum

Fazit Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch optimale Gesamtladung der Proteine berechnet. Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren. Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven. Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund der Proteinstruktur zu erkennen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

Wie stark binden Liganden an Proteine? Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen # Atome Ligand Target Typ    -log K1 1 Ca2+ Amino-transferase IM 6.70 IM: Metallionischer Inhibitor 1 Hg2+ Uroporphy-synthase IM 6.00 1 Mn2+ Inositol-phosphatase IM 5.70 1 Fe3+ Hydroxylase IM 5.30 1 Ag+ Arylformamidase IM 5.00 1 F-   Phosphotransferase IA 4.55 IA: kleiner anionischer Inhibitor 1 S2-   Peroxidase IA 4.28 1 Xe Myoglobin L 2.30 L: Ligand (Agonist oder Antagonist) 1 NH3 Meamine glutamate transferase I 1.79 I: Inhibitor 2 CO Myoglobin L 7.52 2 O2 Myoglobin L 6.18 2 Cyanide Methane oxygenase IA 6.00 2 Hydroxylamine Glycerol oxidase IC 5.92 IC: potentiell kovalente Wechselwirkung 3 Azide Glycerol oxidase IA 5.70 3 Ethylamine Protease I I 3.00 4 Thioacetamide Methan monooxygenase I 5.00 4 NO3-   Carbonate deydratase IA 4.70 4 Vanadate Phytase IA 4.55 5 Thiosemicarbazide Methane monoo xygen. I 6.00 5 SO42-   Creatine kinase IA 5.22 5 Iodoacetamide Methyl transferase IC 5.00 6 Putrescine Spermine synthase I 8.77 6 Aminooxyacetic acid Aminotransferase I 7.19 6 Oxalat Lactate dehydrogenase IA 5.80 7     -Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter L 8.00 7 L-Cysteine Serine acetyl transferase I 6.22 7 Aminomethiozolidine Methyl transferase I 5.40 8 Muscimol     -aminobutylicacid agonist L 8.73 8 Bromopyrimidone Cytosine deaminase I 6.24 8 Phosphonoacetic acid DNA polymerase I 6.00 9 Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I 7.00 9 Methyl iodotyrosine Tyrosine monooxygenase I 6.30 9 Nitrooxazolidinone Aldehyde dehydrogenase I 5.46 9 Benzamidine Trypsin I 4.77

experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 10 Allopurinol Xanthine oxidase I 9.17 10 Acetylcholine Cholinergic receptor L 8.14 10 Cabachol Cholinergic receptor L 7.85 11 Mercapto oxoglutaric Isocitrate dehydrogenase I 8.30 11 Diethyl pyrocarbonate Ca2+ transmitter L 8.80 11 Dopamine    ,   , -androgen receptor L 8.65 12 Norepinephrine Adrenergic agonist L 8.88 12 Nicotine Nicotinic receptor L 8.22 12 Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I I 7.68 13 Tiamenidine     -Adrenergic agonist L 8.66 13 Serotonin 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.30 13 Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase I 7.96 14 Guanabenz     -Adrenergic receptor L 9.02 14 Methylenpenicillanic     -Lactamase I 8.85 14 Captopril Carboxypeptidase I 8.70 15 Aminoclonidine L 9.32 15 Guanfacine     -Adrenergic agonist L 8.73 15 Isatin derivative Rhino protease I 7.30 16 Acetophenone derivative ACEsterase IC 14.89 16 Biotin Streptavidin L 13.43 16 Naphazoline Adrenergic L 8.73 17 Melatonin Melatonin receptor L 8.96 17 Guanine derivative Purine nucleoside phosphorylase I 7.96 17 piperoxan antihyper. receptor L 7.85 18 Iodomelatonin Melanin receptor L 10.68 18 Alprenolol     -adrenergic receptor L 9.47 18 Phosphoramidon Metalloproteinase I 7.55 19 Vesamicol Vesamicol receptor L 9.47 19 Propranolol     -adrenergic receptor L 9.39 19 Trimethopri der Dihydrofolate reductase I 8.53 20 Estradiol Steroid receptor L 9.69 20 Melatonin derivative Melatonin receptor L 9.68 20 Vesamicol derivative Vesamicol receptor L 9.20 21 2-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 12.72 21 4-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 10.55 21 Triprolidine Histamine antagonist L 9.98 21 Trimethoprim dihydrofolate reductase I 8.44 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 22 Amitriptylinoxide Antidepressant L 9.02 22 Mazindol derivative Dopamine transporter L 8.82 22 Indolyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.49 22 Isatin derivative Rhino protease I 8.00 23 Vesamicol der. VR L 11.05 23 Neuraminic acid der. Sialidase I 10.52 23 Melatonin der. melamin receptor L 10.24 23 Vesamicol der. VR L 10.17 24 Vesamicol der. VR L 11.19 24 Isatin der. Rhino protease I 8.70 24 Methadone Narcotic L 8.66 25 Melatonin der. Melamin receptor L 9.62 25 Corticosterone Steroid receptor L 8.51 25 Isatin der. Rhino protease I 8.40 26 Aldosterone Steroid receptor L 9.32 26 Haloperidol Antipsychotic L 9.02 26 Yohimbine     -2 adrenergic receptor L 8.73 26 Isatin der. Rhino protease I 8.40 27 Vesamicol der. VR L 9.74 27 Dexetimide Anticholinergic L 8.80 27 Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I 8.74 28 Vesamicol der. VR L 9.82 28 Indoyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.70 28 Prazosin     1-adrenergic agonist L 9.62 29 Spiperone L 10.27 29 Ketanserin Serotonin antagonist L 9.39 29 Dextromoramide Analgesic L 9.02 30 Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM 12.00 30 Domperidone Dopamine antagonist L 10.13 30 Etorphine Narcotic L 9.91 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.54 31 Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L 8.60 31 Budesonide Glucocorticoid receptor L 8.54 31 Flavin mononucleotide Cytochrome b reductase I 8.10 32 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.34 32 Cyclic urea HIV protease I 8.85 32 Hoechst 33258 DNA L 7.41 33 Methotrexate Dihydrofolate reductase I 9.70 34 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.21 34 Buprenorphine narcotic L 9.83 34 Pimozide antipsychotic L 9.39 34 Hoechst 33342 DNA L 7.44 35 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.52 35 Argatroban Thrombin I 7.72 35 Peptide derivative Thermolysin I 7.29 36 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.15 36 Benzodiazepines Integrin L 8.55 36 Cyclic urea HIV protease I 8.37 37 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.40 37 Cyclic-aza isostere HIV protease I 9.31 37 Benzodiazepines Integrin L 8.80 38 Hydroxypyrone HIV protease I 10.22 38 Cyclic urea HIV protease I 9.92 38 Benzodiazepines Integrin L 8.40 39 Cyclic sulfone HIV protease I 9.52 39 Benzodiazepines Integrin L 7.05 40 Cyclic-aza isostere HIV protease I 11.30 40 Hydroxy pyrone HIV protease I 11.16 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    log K1 41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 12.00 41 Cyclic urea HIV protease I 9.48 41 Cyclic sulfone HIV protease I 9.22 42 Hydroxypyrone HIV protease I 11.10 42 Cyclic urea HIV protease I 9.85 43 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 13.96 43 Cyclic urea HIV protease I 9.48 43 Cyclic sulfone HIV protease I 9.00 44 Cyclic urea HIV protease I 10.41 45 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 10.05 46 Cyclic urea HIV protease I 10.75 46 Cyclic urea HIV protease I 9.51 47 Zaragozic acid A Squalene synthase I 10.11 48 Cyclic urea HIV protease I 10.35 50 Cyclic urea HIV protease I 10.20 50 Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.85 51 Zaragozic acid B Squalene synthase I 10.54 51 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 8.05 52 Cyclic urea HIV protease I 9.37 54 Cyclic urea HIV protease I 10.57 54 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.23 55 Peptide-based Thrombin receptor L 7.40 56 Cyclic urea HIV protease I 10.37 56 Peptide-based Thrombin receptor L 7.92 58 Cyclic urea HIV protease I 10.96 60 Cyclic urea HIV protease I 10.80 62 Cyclic urea HIV protease I 10.62 64 Cyclic urea HIV protease I 10.07 64 Acetyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.00 67 Peptide-based Thrombin receptor L 8.10 68 Stearyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.89 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

Bindungsaffinität  Metallionen oder Metalloenzyme  kleine Anionen  natürliche Liganden Enzyminhibitoren linearer Anstieg der freien Bindungsenthalpie zu Beginn bis ca. 15 Nicht-H-Atome Gbinding = - 60 kJ mol-1 maximal. Dann wird Sättigung beobachtet. Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

Interpretation Metallionen und Anionen binden am stärksten. Nanomolekulare Liganden können bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden. Grössere Liganden - besitzen üblicherweise nur eine kleine Zahl polarer Atome pro Molekül - die elektrostatischen Gruppen der Bindungsstelle werden zunehmend im Inneren begraben - sind oft elektrisch neutral - besitzen mehr entropische Freiheitsgrade -G pro Atom Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern? Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren: (a) kombinatorische Strategien (b) rationale Strategien. Beide Strategien erlauben es in der Praxis effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden; beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM). Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden. Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden ( Kd = 30 pM). Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

CombiSMoG Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB  entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des Proteins Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern: (1) sehr schnell auszuwerten (2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation, entsprechen freien Bindungsenthalpien (3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

CombiSMoG-Algorithmus Dunkelgrünes Fragment wird in Bindungstasche positioniert. Weiteres Fragment aus einer Bibliothek mit 100 organischen Substanzen (blau) wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten optimiert. Fragment wird akzeptiert, wenn neuer Gesamt-Score besser als der alte ist bzw. entsprechend einer Monte-Carlo- Zufallsentscheidung. Die Suche nach weiteren Fragmenten wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung erreicht wird (z.B. maximale Anzahl an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30). Methode kann 50.000 Strukturen pro Tag generieren.

kombinatorisches Liganden-Design Strukturen der 5 Liganden mit den besten Scores. In Klammer die Bewertung nach Optimierung mit dem CHARMM-Kraftfeld. Die lila und hellblauen Moleküle wurden synthetisiert und ihre Kristallstruktur mit HCA bestimmt. Geeignetes Startfragment mit KD = 120 nM um WW mit Zink-Ion zu vermeiden. (H2NO2S-Gruppe hat Kontakt mit Zn2+).

Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design Vorhergesagte Orientierung der R- und S-Stereoisomere In gelb ist jeweils die Kristallstruktur gezeigt. Oben und unten in B sind zwei verschiedene Ansichten gezeigt.

Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten Korrelation für Inhibitoren von HCA, 80 Liganden für für die Kristallstrukturen vorliegen asp: Aspartic Protease met: Metalloproteine misc: ser: Serin-Proteasen sug: Zucker-bindende Proteine

Welche Aminosäuren bestimmen Substratspezifität? Phosphorylierung ist zentraler Bestandteil vieler Signaltransduktionsketten. Proteinkinasen katalysieren Phosphoryltransfer. - ca. 2% von eukaryotischen Genomen kodieren für Proteinkinasen. - Im Mensch gibt es wohl 518 verschiedene Proteinkinasen. Wie kann hohe Substratspezifität erreicht werden? (a) Lokalisation in unterschiedlichen Zellkompartments, (b) selektive Aktivierung durch Kofaktoren (z.B. CDK) (c) Spezifität des aktiven Zentrums bzw. von Substratbindungspositionen für Bindung bestimmter Liganden Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

prokaryotisches Zweikomponentensystem rot und cyan: 2 katalytische Proteinkinase-Untereinheiten Dimerisierung via Helices PO4 –Gruppe wird zunächst von ATP auf konserviertes His in Dimerisierungs-Domäne übertragen blau und magenta: Regulatorprotein. Transfer der PO4 –Gruppe auf Asp Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

Spezifizität bestimmende Residuen MSA : Gruppierung nach Proteinfamilien HK1, HK2, HK3, die jeweils die gleichen Substrate besitzen. Welche Residuen machen die Unterschiede aus? Das konservierte Arg (lila) ist keine spezifitätbestimmende Residue, die roten und blauen Spalten sind dagegen gute Kandidaten. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

Eukaryotische Proteinkinase Phospho-Thr197 gelbes Substratpeptid liegt zwischen den beiden Domänen (rot und blau) der Protein- kinase. In (b) – (d) sind die möglichen spezifitätsbestimmenden Residuen als raumfüllende Modelle gezeigt. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

Numerische Analyse Definiere Ii i Position im Alignment x Aminosäuretyp y Nummer der Familie in einem Alignment Pi(x,y) ist Wahrscheinlichkeit, Aminosäure vom Typ x an Position i in der Familie y zu finden. Pi(x) ist die gleiche W’kt, wobei der Typ der Famile egal ist P(y) ist der Anteil aller Proteine, der zu Familie y gehört. Li, Shakhnovich, Mirny. PNAS 100, 4463 (2003)

Wie gelangen Liganden zum bzw. ins Protein?

Elektrostatische Ausrichtung Manche Proteine müssen Liganden mit starker Netto- ladung bzw. Dipolmoment anziehen. Sie erzeugen (durch geladene Aminosäuren auf ihrer Ober- fläche) ein starkes anziehendes elektrostatisches Potential. Dann wird die kinetische Zeitkonstante kon sehr schnell und das Enzym arbeitet oft am diffusions-limitierten Optimum.

Electrostatic Steering TIM Superoxid Dismutase beta-Lactamase el. Potential Isopotential- flächen Ähnlichkeit des elektrostatischen Potentials bei verschiedenen Mitgliedern der Proteinfamilie bei hinreichender Sequenzidentität ist das erzeugte elektrostatische Potential oft sehr ähnlich. Wade et al. PNAS 95, 5942 (1998)

Transport zwischen 2 Bindungstaschen Multiproteinkomplexe ermöglichen “substrate channeling” zwischen mehreren aktiven Zentren. Ligand diffundiert auf Proteinoberfläche. Dieser Transportmechanismus ist besonders effizient, da ungerichtete, freie Diffusion vermieden wird.

Wie gelangen Liganden ins Proteininnere bzw. wieder heraus? Die Bindung von Liganden im Proteininneren hat die Effekte, - eine Umgebung mit unterschiedlicher (kleinerer) Dielektrizitätskonstante zu schaffen, in der die Elektrostatik eine grössere Rolle spielt, - den Liganden in ein polarisiertes Umfeld zu bringen, das den Übergangs-zustand einer chemischen Reaktion stabilisiert (A. Warshel) - die Reaktion von eventuell störenden Wassermolekülen zu separieren, die zu chemischen Nebenreaktionen führen könnten. Deshalb erfordern manche Proteine (Tryptophan Synthase, Acetylcholinesterase, Cytochrom P450), dass die Liganden durch transient offene Kanäle ins Proteininnere transportiert werden. Zur Betrachtung der Ligandenaffinität gehört demnach auch die Analyse der Pfade ins bzw. aus dem Protein heraus.

AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals

AchE: Konformationelle Kontrolle des Eintrittskanals dynamische Kontrolle der Grösse des Eintrittskanals in Acetylcholinesterase durch zwei aromatische Residuen (lila)

Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden Cytochrom P450cam BM-3 eryF Substrat Kampher: negativ geladene 6-deoxyerythronolide B kompakt, hydrophob Fettsäuren Moleküldynamiksimulationen wurden von gebundenem Zustand gestartet, zufällige „Kicks“ wirken auf den Liganden, damit der Austritt aus dem Protein beschleunigt wird. Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)

Cytochrom P450: mögliche Austrittspfade der Liganden Kristallstrukturen Konformation nach Ligandenaustritt (Simulation) Ligandenaustritt erfordert grössere transiente dynamische Kontrolle kleine Änderungen des Änderungen des der Kanalöffnung Rückgrats, Rotation von Proteinrückgrats durch Arg185 aromatischen Seitenketten  Mechanismus der Protein-Öffnung ist an physikochemische Eigenschaften des jeweiligen Substrats angepasst. Winn et al. PNAS 99, 5361 (2002)

Zusammenfassung Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden. Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann. Für die Zukunft bleibt: (1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden, der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere (2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte (3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)