Nukleare Rezeptoren Ein Überblick Inge Schuster Institut für Pharmazeutisch Chemie Universität Wien

Überblick Signaltransfer in Zellen Was sind Nukleare Rezeptoren? Ursprung und Evolution Nuklearer Rezeptoren Relevanz Strukturelemente Nuklearer Rezeptoren Liganden Allgemeine Mechanismen

Signaltransfer in Zellen Alle Zellen prüfen und verarbeiten permanent Information aus der „Umgebung“ Detektion der Information durch Rezeptoren Information in Form von Mediatoren/ Hormonen: hochspezifische Schlüssel in Rezeptoren Konformationsänderung des Rezeptors Signal auf Gen-Expression Veränderte Funktion

Signaltransfer durch Rezeptoren Intrazelluläre Rezeptoren Membranrezeptoren Extrazelluläre Peptid-hormone, Cytokine... Signal über Kaskade von Protein-Protein Wechselwirkungen zum Nukleus Lipophiles Hormon aktiviert Rezeptor im Nukleus Transkription

Definition: Nukleare Rezeptoren Multi-funktionelle Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren Regulieren die Expression von Targetgenen „Schlüssel-Gene“ in Entwicklung Reproduktion Homeostase Metabolismus Cytosol Ligand Rezeptor DNA Nucleus

Superfamilie: Nukleare Rezeptoren (NR) Sehr große (größte) Gen-Superfamilie, die für eukaryo-tische Transkriptionsfaktoren kodiert NR auf das Tierreich beschränkt NR stammen von einem gemeinsamen Vorläufer ab NR haben den gleichen molekularen Aufbau aus definierten Modulen; MW 50 000 – 100 000 D > 200 verwandte Gene identifiziert: Caenorhabditis elegans (Nematode) ....... > 270 Drosophila melanogaster......................... 21 Homo sapiens.......................................... 48

Phylogenetische Analyse in Säugetieren 48 (49) NR in 6 Subfamilien NR-Vorläufer TR (a,b) RAR (a,b,g) VDR PPAR PXR LXR FXR CAR (a,b) Rev/Erb (a,b) RZR/ROR (a,b,g) UR RXR (a,b,g) HNF-4 (a,b,g) COUP-TF (a,b,g) TLX PNR TR2 (a,b) GR AR PR MR ER (a,b) ERR (a,b,g) Steroid-Rezeptoren NGFI-B (a,b,g) SF-1/FTZ-F1 (a,b) GCNF SHP DAX-1 Liganden bekannt Liganden unbekannt : Orphan Receptors

Chronologie von NR‘s Ecdyson erzeugt Puffs am Chromosom 1959 1970 1980 1990 2000 Ecdyson erzeugt Puffs am Chromosom Steroidhormon – Rezeptoren (AR, ER, GR, MR) VDR , TR RAR PPAR , RXR GCNF, ROR, SF-1; FXR, LXR Orphan receptors

NR in Körperzellen NR in Vielfalt von Zelltypen eines Organismus vorhanden Diese Zellen sind Target für Wirkung der spezifischen NR-Liganden Pleiotrope Effekte auf Zell-/Organ Entwicklung, Homeostase, Metabolismus und Apoptose Beispiel: Vitamin D Rezeptor (VDR) In praktisch allen Körperzellen und Tumorgeweben Reguliert > 60 Gene Calcium Homöostase Proliferation /Differenzierung Immunmodulation

Welche Bedeutung haben NR für Medizin und Pharmazie?

NR und Steroidhormon-Analoga: Publikationen 1960 - 2003 (NIH-library) Agonisten – Antagonisten klassischer NR‘s: herausragende Rolle in Prevention/Therapie benigner und maligner Defekte Gigantisches Potential von Liganden von Orphan Receptors (Reverse Endocrinology)

The Role of Nuclear Receptors in Cardiovascular Disease Neue Aspekte 2003 The Role of Nuclear Receptors in Cardiovascular Disease October 8 - 12, 2003 Hotel Del Coronado, Coronado Island in San Diego, CA Sessions will present the latest developments in nuclear receptor structure and function and will spotlight the emerging roles of key nuclear receptors (PPARs, aldosterone, estrogen and thyroid) in cardiovascular disease. The cutting-edge presentations will range from basic nuclear receptor biology to clinical investigation of agents that target these receptors.

Modulstruktur von NR

NR: Modul-Organisation A/B C D E/F NH2 COO- Variable „Hinge“ Region variable N-terminale Region Konservierte Liganden-Bindungsregion (15–57 %) variabel Konservierte DNA-Bindungs Region: 60-70 aa (42-94 %) Aktivierungsfunktion AF-2 Konstitutive Aktivierungsfunktion AF-1

Modulaufbau von NR‘s A/B C D E/F -COO- ER (estrogen R): 595 aa NH2- -COO- PR (progesterone R): 934 aa NH2- -COO- TR (thyroid hormone R): 408 aa NH2- -COO- RAR (Retinsäure R): 432 aa NH2- -COO- VDR (Vitamin D R): 420 aa NH2-

DNA-Bindungs Domäne – DNA Response Elements

DNA-Bindungs-Domäne (DBD) A/B C D E F DNA NH2 COO- Zn 2 Zink-Finger (60-80 aa) Dimerisierung Sequenzerkennung Response element Recognition a-helix

DNA-Response Elements (RE) Nukleare Rezeptoren binden an RE‘s als Homo-Dimere Hetero-Dimere Monomer 5‘ AGAACAnnnTGTTCT 3‘ 5‘ AGGTCA (n)x AGGTCA 3‘ oder RXR Symmetrisch (Palindrom) GR-GR PR-PR AR-AR ER-ER MR-MR RXR-RXR RZR/ROR SF-1 (M, D,H) Rev-Erb (M,D) Direct Repeat oder Inverted Palindrome RXR-RAR (DR2, DR5) RXR-VDR (DR3, IP9) RXR-PPAR (DR1) RXR-PXR (DR3) RXR-CAR (DR5).....

Hinge domain D NH2 COO- Unterschiedliche Länge und Sequenz bei unterschied-lichen NR Konservierte Domäne bei Isoformen eines NR COO- NH2 Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen LBD und Hinge D – Rolle in Liganden-Bindung, Dimerisierung Signal für nukleare Lokalisation

Liganden-Bindungsdomäne (LBD)

Liganden-Bindungsdomäne (LBD) A/B C D E F NH2 COO- H12 H11 Holo-RAR H12 H11 Apo-RXR Konservierte Struktur aus 12 Helices Konformationsänderung bei Bindung des Liganden Ligand im hydrophoben „Core“ Bilder nach Aranda & Pascual, 2001

Crystallographic structure of the VDRmt bound to 1,25(OH)2D3 Rochel, N., Wurtz, J.M., Mitschler, A., Klaholz, B. & Moras, D. (2000) The crystal structure of the nuclear receptor for vitamin D bound to its natural ligand. Mol. Cell 5, 173–179

Mausefalle-Modell X-Ray Analysen der Ligandenbindungs-Domäne (LBD) von > 15 NR‘s Bindung des Liganden führt zur Konformationsänderung der LBD – Ligand vollständig eingebettet im hydrophoben Core Hochaffine, spezifische Bindung (KD 10-9 – 10-12 M)

LBD -multifunktionell A/B C D E F NH2 COO- AF-2 Bindung des Liganden Dimerisierung (H 10,11, 7.8.9) Reguliert transkriptionelle Funktion durch Interaktion mit „Accessory Factors“ H10 H12 H11

LBD-Dimerisierung LBD DBD RE LBD-Dimerisierung >> DBD-Dimerisierung

Mechanismus der NR-Funktion Aktiver NR Histone acetylation CBP/p300 Dimerbildung RNA Pol II Basal factors NCoA TBP TATA NCoA: Receptor coactivator complex TBP: TATA-Box binding protein

Liganden von NR‘s

NR-Liganden sind lipophile, kleine Moleküle Steroide, Retinoide, Eicosanoide, Thyronin........... MW 300 - 500 (< 1000) D Passive Penetration durch Zellmembranen Templates für Synthese neue Wirkstoffe: Strukturelle Modifikation der Liganden zur gezielten, spezifischen Kontrolle der NR-Funktion Optimierung der pharmakokinetischen Eigenschaften

Woher kommen Liganden der NR? Endogene Metabolite des Lipid-, Steroid-, Vitamin-Stoffwechsels endokrin autokrin parakrin Exogene Verbindungen Nahrung, Umwelt, Pharmaka.........

Liganden - Beispiele Trijod-Thyronin (TR) 1,25(OH)2 Vitamin D3 (VDR) Progesteron (PR) Testosteron (AR) Oestradiol (ER) All-trans Retinsäure (RAR) 13-cis Retinsäure (RXR)

Autokrine – parakrine Regulierung: Vitamin D Synthese und Inaktivierung ebenso wie VDR in Keratinocyten der Haut O H 25 24 D 25(OH)D3 CYP27B 1a,25(OH)2D3 CYP24 Calcitroic acid (Seitenkettenspaltung) 1 7-DHC VDR

Effekt von Liganden auf Gen-Expression Inaktiv Agonist Antagonist Target Gen Inverse Agonist Target Gen Target Gen Target Gen Aktive Konformation Inaktive Konformation

Liganden des Oestrogen Rezeptors (ER) Agonist Antagonist (AF2) ICI 164384 Hydroxytamoxifen Genistein

Agonist -Antagonist NCoA AF-2 Dimerisierung Agonist: Exponierte sites für Dimerisierung und Rekrutierung der Co-Aktivator Komplexe (NCoA) Antagonist: Unvollständige/Fehlende Sites für Dimeri-sierung und/oder Rekrutierung der NCoA-Komplexe

Inhalt des Seminars Klocker Thalhammer Huber Jungbauer Wintersberger RXR (a,b,g) HNF-4 (a,b,g) COUP-TF (a,b,g) TLX PNR TR2 (a,b) GR AR PR MR ER (a,b) ERR (a,b,g) NGFI-B (a,b,g) SF-1/FTZ-F1 (a,b) GCNF SHP DAX-1 TR (a,b) RAR (a,b,g) VDR PPAR PXR LXR FXR CAR (a,b) Rev/Erb (a,b) RZR/ROR (a,b,g) UR Klocker Thalhammer Huber Jungbauer Wintersberger TATA NCoA Basal factors TBP CBP/p300

Literatur Aranda A, Pascual A (2001) Nuclear hormone receptors and gene expression Physiol.Reviews 81:1269-1304 Laudet V (1997) Evolution of the nuclear receptor superfamily: early diversification from an ancestral orphan receptor J.Mol.Endocrinol.19:207-26 Lazar MA (2002) Mechanism of action of hormones that act on nuclear receptors. www.Elsevier-international.com/e-books/pdf/451.pdf