Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)

Überblick Einführung Grundlagen Kryokonservierung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ Kryobanken: Lagerung der Zellen Kryokonservierung von hESC Fallbeispiele Probleme Ausblick Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Einführung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Stammzellen I Embryonale Stammzellen (ESC) [1] Besitzen mindestens zwei Eigenschaften: self renewal durch asymmetrische Zellteilung Pluripotenz Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm) Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2] Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz Abkürzungen aussschreiben 1) Unspezialisierte Zellen mit der Fähigkeit, sich selbst durch asymmetrische Teilung zu erneuern (self renewal) --------------------------------------------------------- http://stemcells.nih.gov/info/basics/basics3.asp -------------------------------------- The human ES cell lines expressed high levels of telomerase activity (Fig. 2). Telomerase is a ribonucleoprotein that adds telomere repeats to chromosome ends and is involved in maintaining telomere length, which plays an important role in replicative life-span (7, 8). Telomerase expression is highly correlated with immortality in human cell lines, and reintroduction of telomerase activity into some diploid human somatic cell lines extends replicative life-span (9). Diploid human somatic cells do not express telomerase, have shortened telomeres with age, and enter replicative senescence after a finite proliferative life-span in tissue culture (10± 13). In contrast, telomerase is present at high levels in germ line and embryonic tissues. ----------------------------------------- Paper: DRZE – Stammzellforschung S.11 ff Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Stammzellen II Adulte Stammzellen im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz) Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc. IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht eindeutig bestimmt Statt „gewinnung aus organen“ etwas derartiges, dass sie inv ielen organen gefunden werden … Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Stammzellen III Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15] 28.01.2011

Gewinnung & Kultivierung ESC Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste Zerstörung der Trophoblasten durch Laserstrahl/Antikörper Kultivierung [3]: Feederzellen Monolayer (inaktivierte murine embryonale Fibroblasten) Koloniewachstum -> 3D Struktur Beschreibung IVF/SCNT – was ist blastozyste/trophoblaste…. 5 tage alt…ethik BRL = buffalo rat liver Andere farbe für hyperlinks Inaktivierung der feeder über mitomycin (klebt DNA zusammen, keine transkription mehr) Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Forschungsziele Lagerung und Bereitstellung von hESC Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung) Klinische Forschung Zell- und Gewebeersatz Immunsystemaufbau (HIV) Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen Lagerung und Bereitstellung von hESC http://www.drze.de/im-blickpunkt/stammzellen Grundlagenforschung: Aufklärung molek. Mechanismen der Spezialisierung von Einzelzellen sowie die Organisation von zellen im Gewebeverbund Mechanismen der Vermehrung/ Differenzierung Klinische Forschung: Tissue Engineering im Hinblick von v.a. Gewebetypen, die nur geringes oder gar kein Regenerationsvermögen besitzen (Nervengewebe) -> Parkinson, MS, Diabetes mellitus Typ I, Herzerkrankungen ---------------- The development of pluripotent stem cells specific to a patient or disease has great promise: first, these stem cells could provide a powerful new tool for studying the basis of the particular human disease and then for discovering and testing drugs for a cure. Second, if patient-specific cells are used in a cell therapy, they would be recognized as ‘self,’ thereby avoiding the serious problems of rejection and immunosuppression ------------ Toxikologie: http://www.stammzellen.nrw.de/aktuelles-presse/archiv/interview-forschen-mit-humanen-embryonalen-stammzellen-aktuelle-entwicklungen.html Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Grundlagen Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2 Der Einfrierprozess Langsames vs. schnelles Einfrieren Zellschäden durch extra- und intrazelluläre Eisbildung Kryoprotektiva als Frostschutz (im)permeable Substanzen Lagerung der Zellen in Kryobanken Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle [16] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Der Einfriervorgang Zwei Einfriergeschwindigkeiten: Langsam (Kristallisation) Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration)  Eutektisches Verhalten Schnell (Vitrifikation) Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt z.B. direkter Kontakt mit lN2  Übersättigte Lösung unkontrolliertes Einfrieren Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Extrazelluläre Schäden Kristallisation Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis dendritisches Wachstum der extrazellulären Wasserphase der Lösung  Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte [14] osmotisch bedingten Schädigung = solution effects, da aufgrund des Wasserausstroms aus der Zelle die intrazelluläre Aufkonzentierung osmotisch wirksamer Teilchen folgt und die Biomoleküle wie Proteine denaturieren mechanisch bedingte Schädigung. d.h. die Zellen schrumpfen übermäßig und es folgen Zelldeformationen, d.h. mechanisch bedingte Denaturierung von Makromolekülen. Weiterhin folgen Lecks in den Membranen, sowohl durch das Schrumpfen als auch den hohen Wasserfluss, was osmotic rupture hypothesis genannt wird. Verlust der semipermeablen Eigenschaften der Plasmamembran Extrazelluläre Schäden Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects) Membranporenbildung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Vitrifikation Zelleffekte bei Vitrifikation Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt) Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung aufgrund von ice seeding durch Membranporen Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]: s. Kryokonservierung zusammenfassung oder VL -> intrazelluläres Eis viel schädigender ----------------------- Mazur et al beschreibt die beiden Vorgänge als gegenläufige Prozesse, die je nach Zellart eine optimale Kühlrate ergeben. Bei langsamem Abkühlen entsteht intrazellulär eine hohe Elektrolytkonzentration, die zur Zellschädigung führt (solution effects). Dagegen ist die intrazelluläre Eiskristallisation Folge einer zu hohen Kühlrate. Aus der Kombination der beiden Vorgänge resultiert eine für jede Zelle spezifische optimale Kühlrate. Das Optimum der Kühlrate ist u.a. abhängig vom Zellvolumen, der Oberflächenstruktur und der Membranpermeabilität der Zelle. Die Zugabe von kryoprotektiva verändert zellspezifisch die Überlebensrate, da sich die optimale Kühlrate zu niedrigeren Werten verschiebt, Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Kryoprotektiva Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben  Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs Permeable Stoffe Impermeable Stoffe Kolligative Effekte Nicht-kolligative Effekte Reduktion der Elektrolytkonzen-tration während des Einfrierens Umstrukturierung der Wassermo-leküle Verringerung der solution effects Stabilisierung der Membranen und Proteine -> intrazelluläre Eisvermeidung Toxisch in hohen Konzentrationen und bei RT Im Allgemeinen geringere Wirkung DMSO, Glycerin, Methanol Trehalose, Hydroxyethylstärke Kolligative Ffekte: Wirkung abhg. Von der Konzentration, nicht von der Art des stoffes. Je mehr, desto besser, jedoch steigt gleichzeitig die Toxizität mit der Konzentratuon. Water replacement hypothesis: H-Brücken des reinen H2O werden gestört und umstrukturiert, wodurch das Eiskristallwachstum gestört wird. Diese Interaktionen führen zu einer Reduzierung der Phasenübergangstemperatur der Membranlipide, wodurch Lecks verhindert werden. Trehalose ist ein guter Glasbildner Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Kryobanken Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …)  Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]: Tabelle: garantierte Lagerzeit vs. Wer weiß schon was… d.h. kann auch viel länger sein http://www.springerlink.com/content/r74021v22207475q/fulltext.pdf -> Tabelle Seite 5: Referenzen für geschriebenen text -> Verweis auf marcs seminar http://www.springerlink.com/content/y357556261472752/fulltext.pdf Material Lagerung Lagerzeit versch. Bakterien, Hefen, Pilze Gefriertrocknung 5 – 35 Jahre Pflanzensamen lN2 > 10 Jahre Stammzellen 15 Jahre Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Kryokonservierung von hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Vorbereitung mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200 Zellen Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit Feederzellen) 10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat Auswahl der geeigneten Abkühlrate Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium [18] [17] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Kryoprotokolle Kontrolliertes Einfrieren Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren Kühlrate variierbar Schrittweises Abkühlen möglich Reproduzierbare Protokolle Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt  Vitrifikation Probe wird direkt in LN2 gefroren 2005-Ware et al. - Controlled-rate freezing of human ES cells.pdf Seite 2, einfrierprotokoll Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Fall 1: Medium + 10 %DMSO Controlled-rate freezing of hESC [8] Kryomedium: 90% Kulturmedium + 10 % DMSO Kryosubstrat: 0,25 ml Cassou Straw Kontrolle: I) ohne Kryokonservierung (Probe A) II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B) Schritt Probe Prozedur Zeit [min] 1 alle Äquilibrierung der Zellen in Kryomedium 15 2 Einfrieren bei -10 °C 3 D – F Ice seeding 5 4 C + D Abkühlen auf -33 °C 1 °C / min E 1,8 °C/ min F 2,7 °C /min C - F Überführung in lN2 > 5 min 6 Auftauen bei Raumtemperatur (RT) 2007-Heng-Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK Enhances the Freeze-Thaw Survival Rate of Human Embryonic Stem Cells.pdf

Fall 1: Medium + 10 %DMSO Vitalität Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus Probe Einfrierrate Vitailität Kontrolle (A) - 100 % Kontrolle (B) direkt bei -80 °C 1 % ± 0,6 C 1 ° C / min 3,0 % ± 2,0 D (seeding) 1 °C / min 79 % ± 15 E (seeding) 1,8 °C / min 65 % ± 20 F (seeding) 2,7 °C / min 20 % ± 10 2007-Heng-Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK Enhances the Freeze-Thaw Survival Rate of Human Embryonic Stem Cells.pdf Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Fall 2: Medium + Trehalose Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4] Kryomedium: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose Kryosubstrat: 0,5 ml Kryovial Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2 Kontrolle: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO Trehalosekonzentration nach Standard für menschliche Hematopozyten Probe Kryomedium Auftaumedium Kontrolle (A) - B mit Trehalose C D

Fall 2: Medium + Trehalose Differenzierungsstatus: n = 75 Kolonien Jüngere Passagen erholen sich besser nach der Kryokonservierung Probe Undifferenzierte Kolonien [%] Passage 28 Passage 38 A 16 13 B 41 35 C 43 44 D 51 45 AKP Färbung und Morphologie, pluripotenz über AKP und SSEA-4, Karyotyp und Teratoma-Bildung, Vitalitätswerte sind werte der summe aller prozentzahlen der verschiedenen passagen,d ie getestet wurden. Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Problematik 3D-Struktur der hESC Kryoprotektiva Proben & Arbeitsweisen Temperatur- & Kryoprotektivumgradienten Verlust der Pluripotenz nach dem Auftauen Dissoziation der Zellklumpen kann zu Zelltod führen Zell-Zellkontakt unterbrochen durch extrazelluläre Eisbildung Kryoprotektiva Spezifische Auswahl wichtig Toxizität bei Raumtemperatur Proben & Arbeitsweisen Verschiedene Zelllinien & Passagen Unterschiedliche Handhabung der Kryokonservierung die optimale Kryokonservierung ist von vielen Faktoren abhängig Zell-Zellkontakt geht verloren durch extrazelluläre eisbildung, multizelluläre systeme! Problematik kryoprotokoll -> unterschiedliche ansichten, unterschiede in ausgnagsmaterial, passage, zelllinie, …. Proben-/Laborspezifische unterschiede als Überpunkt Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Ausblick hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt: regenerative Medizin Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung Individuelles Testsystem für Pharmazeutika Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung Kryokonservierung ist ein vielversprechender , aber teilweise noch unausgereifter Ansatz für die Lagerung biologischer Proben Potential für die regenerative medizin (vllt kurz teratoma erwähnen) Grundlagenforschung embryonalentwicklung… (s. folie forschungsziele) Immer noch sehr wenig wissen über differenezierung etc. Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Dankeschön für die Aufmerksamkeit! Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011

Quellen [1]: Human embryonic stem cells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007, 113: 5-10 [2]: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5 [3]: Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145 [4]: Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu et al., Reproductive BioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739 [5]: The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion medicine Hemotherapy, 2007, 34: 293-304, [6]: A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 [7]: Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213 [8]: Controlled-rate freezing of human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson, Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 [13]: Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000 http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html [14]: Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual review of Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187 [15]: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc- pathway.Par.0001.Image.566.gif [16]: http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg [17]: Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg [18]: Kryo straws, http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011