Orthotopes Tumormodell Stand: 29.05.2006 Aufnahmestudien Orthotopes Tumormodell Stand: 29.05.2006

Durchführung I Tier: Maus c57/B16 Tumorzellimplantation: 2·105 MB 49-Zellen Makrohämaturie intermittierend (zeitweilig aussetzend) bei allen Tieren nach 20 Tagen, nur Maus 2 noch am Therapietag Therapiebeginn: Tag 26 Narkose mit Pentobarbital, Kathetereinlage Therapie mit Instillation und sofortiger Katheterentfernung (entspricht Wirkdauer von etwa 1h)

Durchführung II Therapie: Maus 1 50 µl intravesikal 10 µM siRNA (Bemerkung: bei Maus 3 para gelaufen  daher fragliche Therapie) Maus 4 50 µl intravesikal 10 µM siRNA + DOTAP (1:1) Maus 5 50 µl intravesikal 1 µM siRNA + DOTAP (1:1) Maus 6 50 µl intravesikal 0,25 µM siRNA + DOTAP (1:1) Maus 7 50 µl intravesikal PBS

Durchführung III Opferung: Tag 27, 12h nach Therapie Blasengewicht Maus 1 25 mg Maus 2 63 mg Maus 3 40 mg Maus 4 19 mg (wahrscheinlich kein Tumor) Maus 5 49 mg Maus 6 28 mg Maus 7 45 mg

Durchführung IV Aufarbeitung: Kryokonservierung von Blase und Nieren (jeweils mit Harnleiter) Blasen aufgeschnitten  Tumor nach oben  auf Korkblättchen Gefrierschnitte  Bemerkung: aufgrund der gewellten Gewebe konnten nie vollständige Schnitte angefertigt werden und innerhalb der Schnitte sind z.T. alle Schichten der Blasenwand vertreten Fluoreszenzmikroskopie von einigen Ebenen HE-Färbungen und Begutachtung durch Pathologen die Nieren und Harnleiter wurden noch nicht aufgearbeitet

Fluoreszenzmikroskopie DAPI-Färbung der Zellkerne Detektion der FITC- und DAPI-Fluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskopie Deutlich sichtbar: Bereiche stark vergrößerter, verdichteter Zellkerne  Vergleich mit HE-Färbungen zeigte, dass es sich um Tumorbereiche handelt HE-Färbungen Ausbreitung der Tumoren: Tumoren wachsen hauptsächlich oberflächlich; bei Maus 7 aber definitiv muskelinvasiv; bei anderen Mäusen z.T. nicht genau feststellbar

D Maus 2, HE (gleicher Ausschnitt wie Fluoreszenzbild) A Maus 1, B Maus 2, C Maus 3, D Maus 2, HE (gleicher Ausschnitt wie Fluoreszenzbild)

links: Fluoreszenzmikr., rechts: HE-Färbung (gleicher Ausschnitt) Maus 1: links: Fluoreszenzmikr., rechts: HE-Färbung (gleicher Ausschnitt)  FITC in Muskelschicht

Maus 7, 100fache Vergrößerung

Ergebnisse Maus 1 bis 3: deutlich sichtbar Abnahme der FITC-Fluoreszenz in der Blasenwand (Folie 7) Sichtbar am HE der Maus 2: FITC nur in Urothelschicht (Folie 7) Bei Maus 1 konnte geringe FITC-Intensität auch in Muskelschicht detektiert werden (Folie 8) Maus 4 bis 6: ns-siRNA + DOTAP geringere Fluoreszenzintensität als bei Maus 1 bis 3 (ohne Lipidcarrier applizierte Konstrukte)  alle Bilder liegen bei Maus 7: PBS-behandelt  keine FITC-Fluoreszenz detektiert (Folie 9)

Bemerkungen alle aufgenommenen Fluoreszenz- und HE-Bilder liegen bei  die Vergrößerung und die Schnittebene („E“; Blasen wurden von oben {E.1} in Richtung Korkblättchen geschnitten) sind jeweils im Dateinamen angegeben  Fluoreszenzaufnahmen: es wurden jeweils die DAPI- (c2) und FITC-Fluoreszenz (c1) extra aufgenommen und übereinander gelegt (c1+c2) HE-Färbungen: hier wurden jeweils Fotos von den Bildausschnitten gemacht, von welchen auch Fluoreszenzaufnahmen vorlagen; von Maus 3 liegen keine HE-Bilder vor, da die Schnitte größtenteils vom Objektträger abgespült waren