Patch – Clamp – Ableitungen _____________________________________________________________ - Einführung - Methodik - Auswertung von Rohdaten - Fazit / Ausblick

Einführung - Entwicklung 1976 (Nobelpreis 1991) Erwin NEHER Bert SAKMANN

The Nobel Prize in Physiology or Medicine for 1991 is awarded for the discoveries of the function of ion channels. The two German cell physiologists Erwin Neher and Bert Sakmann have together developed a technique that allows the registration of the incredibly small electrical currents (amounting to a picoampere - 10-12A) that passes through a single ion channel. The technique is unique in that it records how a single channel molecule alters its shape and in that way controls the flow of current within a time frame of a few millionths of a second.

Revolution ! - hohe räumliche Auflösung  Untersuchung von Einzelkanalströmen unter verschiedensten Bedingungen möglich; damit: Größe von Einzelkanalströmen / (In-) Aktivierungskinetik, Einflüsse

Cell- Attached: physiolog. Bedingungen; EM unverändert Whole-Cell: Summenstrom Inside-Out: Wirkung intrazellulärer Transmitter (isoliertes Fragment) Outside- Out: Wirkung extrazellulärer Transmitter

Methodik Der Patch-Clamp-Verstärker 1: Differenzialverstärker erzeugt eine Spannung, die in linearer Beziehung zur Spannungsdifferenz an beiden Eingängen steht 2: Eingangswiderstand liegt in Größenordnung von 1012 Ω 3: Spannungsabfall über Rf ist proportional zur Stromstärke zwischen 1 und 2

Anvisierung der ausgewählten Zelle im LM mit der Elektrode verwendete Zellen: Neuroblastoma-Tumorzellen der Zelllinie B35 von Rattenembryonen Zugabe von K+-Kanal-Blockern (Ziel: Untersuchung der Na+-Kanäle) Anvisierung der ausgewählten Zelle im LM mit der Elektrode

kurz vor Berührung: Überdruck-Erzeugung 2 Informations-Quellen über Abstand der Elektrode zur Zelle: akustische Informationen über den Widerstand visuelle Informationen durch Eindrücken der Zellmembran aufgrund des Überdrucks Nach hinreichender Annäherung: Erzeugung eines Unterdrucks

Ansaugen der Zellmembran (Cell-attached- Ansaugen der Zellmembran (Cell-attached- Konfiguration): Gigaseal erkennbar durch flachere Stromspur Minimierung der kapazitiven Ströme notwendig Weiter Unterdruck sorgt für Aufreißen der Zellmembran (Whole-Cell-Konfiguration) Erneute Minimierung der kapazitiven Ströme nötig Ausführung verschiedener Messprotokolle Datenauswertung

Auswertung: von den Rohdaten zur Erkenntnis…

Welche interessanten Größen lassen sich aus den Rohdaten bestimmen ?  Messung eines (Ionenkanal-) Stroms bei vorgegebener Spannung U = R * I  I = U / R = U * g

Strom – Spannung Aktivierung Inaktivierung Refraktärität

Strom-Spannungs-Kurve Ergebnisse Protokoll: Sodium 1 Haltepotential: Ruhemembranpotential bei -80 mV Dann: 15 Spannungssprünge für jeweils 45 ms in Zehnerschritten von -60 mV bis +80 mV

Der Strom wird gegen die vorgegebene Spannung aufgetragen Es gibt 3 Phasen sowie 2 wichtige Größen

3 Phasen: Einwärtsstrom Anstieg bis Epeak Abfall bis Erev Auswärtsstrom 2 wichtige Größen: Epeak Erev

Aktivierungskinetik  Zusammenhang zwischen Membranspannung E und Leitfähigkeit g der (Natrium-) Kanäle INa gNa = -------------- E - Erev gemessene Spannung ENa (50 mV) gesetzt

(normiert) Boltzmann g 1 ----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]

E 0.5 g 1 ----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]] E0.5 ist die Spannung, bei welcher die Hälfte aller Na+ - Kanäle geöffnet ist (halbmaximale Gesamtleitfähigkeit !)

g 1 ----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]] k verhält sich invers zur Steilheit der Kurve (etwa zur Steigung bei E0,5)  Maß für die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung (je kleiner k, desto größer)

Zelle E(1/2) k 2 -0.031 0.009 -0.029 0.00825 3 -0.0469 0.0051 -0.046 0.005 4 -0.037 0.01 -0.0368 0.0122 5 -0.036 0.0078 -0.0369 0.0079 6 -0.045 0.011 7 -0.0426 0.012 Mean -0.03872 0.008825 VAR² 0.00619889 0.00254638

Variabilität von E 0.5 und k : zell- und zelltypspezifische Unterschiede in Expressionsmustern verschiedener (Sub-) Kanaltypen…

Inaktivierungskinetik Noch während der Depolarisation schließen die Nav-Kanäle wieder Diese Inaktivierung findet mit zeitlicher Verzögerung (ms) statt und ist für Repolarisation zurück zum Ruhepotential der Zellmembran mitverantwortlich

Untersuchung der Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung im Gleichgewichtszustand Spannung für depolarisierende Konditionierung: -120mV bis -30mV in Schritten von 10mV Dauer der Depolarisation: 100ms

- Steady-State-Inaktivierung mit NaInact1-Protokoll Auswertung: - Steady-State-Inaktivierung mit NaInact1-Protokoll - Stromamplituden während Spannungssprung nach Epeak auf maximalen Einwertsstrom normieren - Auftragen von E; I /I(max); Boltzmann-Fit E1/2 : Spannung, bei der die Hälfte der Nav-Kanäle inaktiviert sind k : Im steilsten Bereich der Kurve ist die Spannungsabhängigkeit am größten

Idealbild einer Inaktivierungskurve

Beispielhafte Auswertung einer Zelle E in mV I/I(max) boltzmann Δ² -1.20E-01 0.97430824 0.99827987 0.00057464 -1.10E-01 1 0.98949616 0.00011033 -1.00E-01 0.90028672 0.93861689 0.0014692 -9.00E-02 0.7376619 0.7128141 0.00061741 -8.00E-02 0.28075044 0.2871859 4.1415E-05 -7.00E-02 0.08220838 0.06138311 0.00043369 -6.00E-02 0.04514798 0.01050384 0.00120022 -5.00E-02 0.04333555 0.00172013 0.00173184 -4.00E-02 0.04783218 0.00027961 0.00226125 -3.00E-02 0.0498849 4.5398E-05 0.00248398 -2.00E-02 0.03855515 7.3693E-06 0.00148593 -1.00E-02 0.04430696 1.1962E-06 0.001963 E(0.5) -0.085 k -0.0055

Refraktärität Wiederaktivierung zeitabhängig (Refraktärzeit) Na+-Kanäle nach AP inaktiviert Wiederaktivierung zeitabhängig (Refraktärzeit) Schnelligkeit der Aktionspotential-Wiederholungen limitiert absolute Refraktärzeit nach AP: weiteres AP kann unter keinen Umständen ausgelöst werden relative Refraktärzeit nach AP: weiteres AP kann durch starke Spannungspulse ausgelöst werden (erhöhtes Schwellenpotential, schwächere APs)

Rec 1: zweiter Spannungspuls in 1ms-Abständen verschoben

Rec 1: Ergebnisse

Rec 1: Auswertung: I2/I1 im Zeitverlauf Sättigungsfunktion

Rec 2: zweiter Spannungspuls in exponentiellen Abständen verschoben

Rec 2: Ergebnisse

Rec 2: Auswertung (I2/I1 im Zeitverlauf) Sättigungsfunktion

Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 

Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 

Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung: 

Patch-Clamp: Fazit Vorteile - Besseres Signal-Rausch-Verhältnis als bei Intrazellulärableitungen - Ableitungen von einzelnen Kanälen möglich Nachteile Keine Ableitung von neuronalen Netzwerken möglich Für gute Ableitungen braucht man Einiges an Übung und Geschick

Ausblick : Planares Patch - Clamp - keine adhärenten Zellen, sondern Zellsuspension auf einem Chip - Zellen werden durch eine Öffnung im Chip angesaugt (Gigaseal); daraufhin wird abgeleitet

Spiel gefällig?  www.science-display.com/patchclamp.html