Praktikum der Mikrobiologie 2. Kursstunde Biologische und biochemische Untersuchungsmethoden

2. Kursstunde Biologische und biochemische Untersuchungsmethoden Auswertung des Dreiösenausstrichs (Platten Kursstunde 1) Katalase Test Oxidase Nachweis O / F Test Glucose, Beweglichkeit Beimpfen 'Bunte Reihe' Anlegen Agardiffussionstest Hämolyseformen

1. Aufgabe: Auswertung Dreiösenausstrich aus 1. Stunde Allgemeines zu biologischen und biochemischen Untersuchungsmethoden: Biologische & biochemische Leistungskriterien werden zur Identifizierung einer Keimart bzw. Differenzierung gegenüber anderen Keimarten herangezogen.

Biologisch physiologische Kriterien: Koloniemorphologien Wachstumsverhalten auf Universal- und Selektivmedien Einfluss von Wuchs- und Hemmstoffen Sauerstoffbedarf Temperatur Beweglichkeit pH-Wert Färbeverhalten

Typische Kolonieformen punctiform

Sauerstoffbedarf obligat aerob obligat anaerob fakultativ aerob fakultativ anaerob mikroaerophil (O2 , 5%) kapnophil (CO2, 5 - 10 %) Wachstumsverhalten in Thioglycolatbouillon

Nährmedien (Auswahl) Blutagar Nähragar 5% defibriniertes Schafblut, Fleischpepton, Fleischextrakt, Kochsalz zur Anzüchtung sowohl von grampositiven als auch gramnegativen Bakterien Nähragar ohne Blutzusatz, für wenig anspruchsvolle Keime

Nährmedien (Auswahl) Mac Conkey-Agar: Fleischpepton, Laktose, Gallensalze, Kristallviolett, Neutralrot, Kochsalz zur Anzüchtung gramnegativer Keime (Gallensalze & Kristallviolett hemmen die Vermehrung grampositiver Keime) Neutralrot bewirkt die Färbung der Kolonien (rot) Laktose-Fermentierender Keime (pH-Verschiebung)

Mc Conkey-Agar A = Laktose positiv B = Laktose negativ

2. Aufgabe: Katalase-Nachweis Mit einer Öse jeweils eine Kolonie Enterococcus faecalis und Staphylococcus aureus vom blutfreien Medium abnehmen (ohne Agarreste!) und auf einen Objektträger geben Auf die Biomasse jeweils 1 Tropfen H2O2 (3%) geben Bei Anwesenheit von Katalase wird Sauerstoff freigesetzt Bläschenbildung! 2 H2O2  2 H2O + O2

2. Aufgabe: Katalase-Nachweis Mit einer Öse jeweils eine Kolonie Streptococcus agalactiae, Escherichia coli und Morganella morganii vom blutfreien Medium abnehmen (ohne Agarreste!) und auf einen Objektträger geben Auf die Biomasse jeweils 1 Tropfen H2O2 (3%) geben Bei Anwesenheit von Katalase wird Sauerstoff freigesetzt Bläschenbildung! 2 H2O2  2 H2O + O2

3. Aufgabe: Oxidase-Nachweis Einen Tropfen Oxidasereagenz auf den Filterpapierstreifen auftropfen (gummierte Fläche nach unten!) Je eine Kolonie Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli und Acinetobacter sp. mit der Impföse abnehmen und auf dem Filterpapier verreiben Oxidase-positive Keime färben sich innerhalb weniger Sekunden blau an

3. Aufgabe: Oxidase-Nachweis Oxidation von N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylenediamine Dihydrochloride

4. Aufgabe: Oxidations-Fermentationstest (O/F) Beweglichkeitstest Pro Arbeitsplatz jeweils einen O/F/B-Satz mit einer der 3 Bakterienarten, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli oder Acinetobacter sp., beimpfen Mit einer Stichöse jeweils eine Bakterienkolonie von der Agarplatte nehmen

Oxidations-Fermentationstest (O/F) Das 'Oxidations'röhrchen wird dicht unterhalb der Oberfläche beimpft. Dazu Agaroberfläche leicht 'umrühren'. Das Fermentationsröhrchen ist mit Paraffin überschichtet. Beschriften Sie die Röhrchen mit Keimart und Platznummer! Ausgangszustand oder kein Glucoseabbau Oxidativer Abbau nur aerob Säurebildung nur im offenen Röhrchen Farbumschlag nach gelb Fermentativer Abbau aerob und anaerob Säurebildung in beiden Röhrchen Farbumschlag nach gelb

Beweglichkeitstest Unter sterilen Kautelen das jeweilige Agarröhrchen mit einem Stich beimpfen. Mit einer Stichöse eine Bakterienkolonie von der Agarplatte nehmen Beschriften Sie die Röhrchen mit Keimart & Platznummer!

5. Aufgabe: Bunte Reihe Zusammenstellung diskriminierender (biochemischer) Testreaktionen zur Differenzierung von Bakterien aus der Familie der Enterobacteriacae. Die einzelnen biochemischen Reaktionen werden auch zur Identifizierung anderer Bakterienarten herangezogen! Testdauer: 1-2 Tage

Reihenfolge: Kligler Tryptonbouillon Harnstoffagar Citratagar Mannitbouillon Adonitbouillon Sorbitbouillon Lysinbouillon Ornithinbouillon Voges Proskauer Beweglichkeitsmedium

Beimpfung der 'Bunten Reihe' (1) Es werden 3 verschiedene Stämme (1,2,3) ausgeteilt, pro Arbeitsgruppe wird eine Bunte Reihe beimpft Beimpfen Sie das Tryptonröhrchen (2.Röhrchen, farblos) mit 1 Kolonie des Stammes. Gut suspendieren! Entnehmen Sie dann aus dem Tryptonröhrchen mit einer Pasteur-Pipette ca. 1ml und beimpfen Sie die restlichen Röhrchen mit jeweils 0,1ml (4-5 Tropfen) CAVE: NICHT das erste und letzte Röhrchen!!

Beimpfung der 'Bunten Reihe' (2) Als letztes Röhrchen beimpfen Sie den Kligler-Schrägagar. Beimpfen Sie möglichst die gesamte Schrägfläche und stechen Sie zum Schluss in den Agar hinein (2-3cm tief) Das Beweglichkeitsröhrchen wird durch vorsichtiges Einstechen mit der Pasteur-Pipette in den Agar beimpft Die beiden AS-Bouillons (Lysin, Ornithin; lila) werden von den Assistenten mit flüssigem Paraffin überschichtet.

6. Aufgabe: Anlegen eines Blättchentests Testkeim: Escherichia coli 2-3 Kolonien einer Reinkultur werden in 5 ml phys. NaCl suspendiert. Mueller-Hinton Agarplatte mit der Suspension mit sterilen Wattestäbchen gleichmäßig beimpfen. 6 Testblättchen (verschiedenen Antibiotika) werden mit Hilfe eines Dispensers aufgelegt. Beschriftung nicht vergessen!

7. Aufgabe: Hämolyseformen

 -Hämolyse Vergrünung (z.B. Streptococcus pneumoniae) Freisetzung von H2O2 führt zur Entstehung von Methämoglobin. Die Erythrozytenmembran bleibt weitgehend unbeschädigt.

 -Hämolyse Vollständige Hämolyse (z.B. Streptococcus pyogenes) Auflösung der Erythrozyten durch Hämolysine

 -Hämolyse Nicht-hämolysierende Streptokokken, z.B. Enterokokken

Beispiele Kulturen S. marcescens S. aureus P. aeruginosa E. sakazakii

Exophiala dermatitidis Beispiele Kulturen Chromobacterium violaceum Exophiala dermatitidis Rhodotorula rubra