Integrin inside-out Signaltransduktion in der T-Zelladhäsion Adhesion-Assay auf ICAM-1 Betreuerin: Jessica Grell

Zielsetzung Untersuchung der Interaktion des Integrins LFA-1 mit seinem Liganden ICAM-1 Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Stimulatoren, sowie 2 verschiedener Inhibitoren

Integrine wichtigste Familie der Adhäsions-Proteine transmembrane α/β-Heterodimere: grosse extrazelluläre Domäne & kürzere transmembrane und intrazelluläre Domäne Interaktion mit verschiedenen Liganden möglich bei Leukozyten häufig β2-Integrine Regulation durch Modulation von Affinität und Avidität

Affinität: Stärke, mit der ein einzelnes Integrinmolekül an seinen monomeren Liganden bindet Änderung führt zu Konformations- änderung Avidität: gesamte Bindungsstärke zwischen multimeren Integrinmolekülen & ihren Liganden Erhöhung durch Aggregation der Integrine auf der Zelloberfläche

Adhesion assay Adhäsion der T-Zellen an ICAM-1 wird durch LFA-1 vermittelt LFA-1 bindet nicht konstitutiv an seinen Liganden: Aktivierung durch intrazelluläre Signale nötig verschiedene extrazelluläre Stimuli werden verwendet, um intrazelluläre Signale auszulösen verwendetet Stimuli: PMA = Phorbolester; Strukturanaloga von DAG; aktiviert PKC OKT 3 = aktivierender TCR-Antikörper KIM 185 = aktivierender LFA-1-Antikörper

Inhibitoren 1.) SecinH3 Bindet spezifisch an Sec7-Domäne von Cytohesinen Inhibierung des Guaninnukleotid-Austausches (GEF-Funktion) Cytohesin-1 = positiver Regulator von LFA-1 & bindet direkt an zytoplasmatische Domäne von CD18 2.) Gö6850 (Bisindolylmaleimid I) Inhibitor von Proteinkinase C : bindet an ATP-Bindungstelle

Versuchsdurchführung Coaten von 3 cm Schalen mit ICAM-1-Fc : Beschichtung der Schalen mit goat-ant-human IgG Antikörper ICAM-1-Fc : Fusionsprotein; carboxyterminaler Fc-Teil aus CH2 und CH3 Domäne von humanem IgG1 Fc-Teil wird von anti-human-IgG gebunden -

Versuchsdurchführung Vorbereitung der Zellen 1,6 × 107 Jurkat-Zellen Zugabe von Inhibitoren; Kontrolle nur mit DMSO 60 min Inkubation bei 37 °C Auftragen der Zellen auf Schale & Zugabe der jeweiligen Stimuli Adhäsion der Zellen für 60 min bei 37 °C Waschen der Schalen mit HBSS bis keine Zellen mehr ausserhalb der Markierung sind Zählen der Zellen

Ergebnisse Inhibitor: SecinH3 Stimulierung mit OKT3 wird stark gehemmt Inhibitor zeigt wenig Wirkung bei Stimulation mit KIM185

Ergebnisse Inhibitor: Gö6850 Bei PMA- Stimulierung wird am stärksten inhibiert

Fazit PMA ist ein besserer Stimulator als OKT3 PMA- und OKT3-Stimulation werden stark von den beiden Inhibitoren beeinflusst beide stimulieren intrazellulär den Signalweg KIM185 stimuliert trotz Inhibitoren Stimuliert LF-1 von aussen; keine Aufnahme in die Zelle nötig; wirkt Inhibitor stark entgegen Inhibitoren wirken beide stark SecinH3: GEF-Funktion von Cytohesinen ist wichtig für die Aktivierung von LF-1 Gö6850: Hemmung von Cytokinase C führt zum Abbruch des Signalweges