muva kempten Dr. Monika Knödlseder Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele muva kempten Dr. Monika Knödlseder

Beispiele: Bifidobakterien Laktobazillen Cronobacter PCR

Bifidobakterien

werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt Bifidobakterien werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt keine „offizielle“ spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E) Für Milchprodukte Bifidobakterien ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E) Für Milchprodukte IDF – Ringversuch 2006 21 Labore (Europa, Japan und Neuseeland) Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP) Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen) Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert

Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur) Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren 12 - 15 ml TOS-MUP-Agar Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur Evtl. F6PPK Assay Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: Alle Platten mit ≤ 300 Gesamt-Kolonien Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen

Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.

Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich muva-Methode Nachweis mit RCM-Agar Spatelverfahren anaerob Methode 2 ISO-Vorschlag Nachweis mit TOS- MUP- Agar Gussplattenverfahren anaerob

Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar

Bifidobakterien Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber: RCM - Agar TOS - MUP - Agar Kolonieform stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen häufig sehr kleine Kolonien produktunabhängig große, deutlich erkennbare Kolonien Mikroskopisches Bild z. T. nicht eindeutig -> weitere Differenzierungen eindeutig Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken) meist stark vorhanden wenig Eignung der Methode prinzipiell geeignet z. T. aufwendige Differen- zierung erforderlich methodische Erfahrung sehr gut geeignet i. d. R. keine weitere Differenzierung notwendig

Nachteil: Bezug des Nährbodens in Japan Bifidobakterien Nachteil: Bezug des Nährbodens in Japan kein europäischer Anbieter (derzeit)

LAKTOBAZILLEN

gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?! am Beispiel LAKTOBAZILLEN

Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4 Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie -> KOH: negativ -> Katalase: negativ - Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien) Identifizierung der Spezies: ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie

Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1 Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – „gleiche“ Ergebnisse Produkt Joghurt MRS-Merck MRS-Difco MRS-Heipha MRS-Sifin   KBE/g FTIR-Ident. Probe 1 340.000 Lb. acidophilus 410.000 440.000 420.000 210.000 Lb. delbrueckii 280.000 260.000 Probe 2 67.000 Lb.delbrueckii 62.000 63.000 60.000 Probe 3 5.700.000 5.800.000 4.400.000 4.200.000 Probe 4 5.200.000 5.600.000 Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25% Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1 Lb. delbrueckii Probe 2 Lb. delbrueckii Probe 3 Lb. delbrueckii Probe 4

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Matrix MRS - Merck MRS - Difco MRS - Heipha KBE/g FTIR-Ident. Kultur Lb. delbrueckii 1.700 66.000.000 * Kolonien schwer abimpfbar, *Bestätigungsreaktionen möglich * keine FTIR - Identifizierung 32.000.000 * Kolonien schwer abimpfbar * Bestätigungsreaktionen möglich Joghurt 1 mit 600   240.000 Joghurt 2 mit 260.000 520.000 Joghurt 3 mit < 100 nur Sc als Fremdflora 560.000 * Laktobazillen, vermutlich Lb. delbrueckii * kein Wachstum auf FTIR -Agar Joghurt 4 mit 400 700.000

gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Kultur Lb. delbrueckii Joghurtproben mit Kultur Lb. delbrueckii

Laktobazillen Zusammenfassung: Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco-Agar bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR-Identifizierungsergebnis

Zusammenfassung: Aber: Laktobazillen Zusammenfassung: Aber: in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies) bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)

Cronobacter – E. sakazakii

Enterobacter sakazakii ISO/TS 22964 IDF/RM 210:2006 Probe: -milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories Inkubation bei 37 ± 1 °C für 18 h ± 2 h gepuffertes Peptonwasser Inkubation bei 44 ± 0,5 °C für 24 ± 2 h Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden Inkubation bei 44 ± 1 °C für 24 ± 2 h Bestätigungstests

Prüfmittel Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten Selektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiert

Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung Cronobacter Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung Optimierung des Verfahrens Horizontales Verfahren Derzeit in der Diskussion: Inkubation der Selektivmedien 22-26 h bei 41,5 ± 1 °C Austausch der Selektivmedien Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST) Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)

PCR - Verfahren

Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie Hohe Spezifität Hohe Sensitivität Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie Gesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar Vielseitige Einsatzmöglichkeiten Mikrobiologie GMO Tierartendifferenzierung Pathologie…… Potential der PCR

Wie geht man mit positiven Befunden um? PCR / real – time PCR Wie geht man mit positiven Befunden um? Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?

PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG) (2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind…. Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen die Rückstellproben des Probenmaterials die Isolate während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.

Was tun?

Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen Laborkompetenz: Bsp. Kompetenz des Labors Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen Laborkompetenz: Bsp. Ringversuche Interne Kontrollen Prüfmittelüberwachung Schulung - Laborbegehungen Qualitätssicherung im Labor Mikrobiologisches Fachwissen

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Unser Team: Dr. Christine Bürk Dr. Ursula Hartmann Marion Seidl Isolde Degle Dr. Karlheinz Friedrich Dr. Monika Knödlseder

5.3 Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar 5.3.1 Composition Tryptic digest of casein Yeast extract Sodium chloride (NaCl) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside Sodium desoxycholate (C24H39NaO4) Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3) Sodium thiosulfate (Na2S2O3) Agar Water Kein Crystal violet

5.2. Cronobacter screening broth (CSB) 5.2.1 Base medium Enzymatic digest of animal tissues Meat extract Sodium chloride (NaCl) (weniger) Bromocresol purple Sucrose (C12H22O11) Water 5.2.2. Vancomycin solution

Bifidobakterien –Nährmedien Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung Zusammensetzung RCM-Agar TOS-MUP-Agar Pepton tryptisch verdaut 10 g Hefeextrakt 3 g 1 g Fleischextrakt   Glucose 5 g Stärke NaCl Na-Acetat Cysteinhydrochlorid 0,5 g L-Cystein HCl x H2O Natriumpropionat 15 g Galactooligosaccharide 10g KH2PO4 K2HPO4 4,8 g (NH4)2SO4 MgSO4x7H2O 0,2 g Agar 12,5 g pH 5,9 6,3 Mupirocin 50 mg/l Hersteller z.B. Merck, Oxoid, Sifin derzeit nur Yakult Pharmaceuticals, Japan

Laktobazillen - Nährmedien Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller MRS-Agar - Zusammensetzung g/l Merck Difco Heipha Sifin Art.Nr. 1.10661  288210 506200 TN1068 Pepton aus Casein 10,00 Fleischextrakt 8,00 10,00  Hefeextrakt 4,00 5,00 D(+)-Glucose 20,00 20,00  Dikaliumhydrogenphosphat 2,00 2,00  Tween® 80 1,00 1,00  ─ Di-ammonium-hydrogencitrat Natriumacetat 5,00  Magnesiumsulfat 0,20 0,10 Mangansulfat 0,04 0,05  0,05 Agar 14,00 15,00  13,00

Übersichtsschema

Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses: Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien Alle Kolonien werden gezählt Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet

Kompetenz des Labors Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden? Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil? Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)

Staphylokokken-Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft → Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs: 2.2.3. Käse aus Rohmilch 2.2.4. Käse aus Milch, wärmebehandelt ….. 2.2.5. Frischkäse aus Milch … , wärmebehandelt …. 2.2.7. Milch- und Molkepulver Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 105 KBE/g → Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g

Nachweis von SET- Problematik falschpositiver Ergebnisse In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich: es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren: Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung Thermonuklease-Nachweis (Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind) Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil) (aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)

Eingesetzte Volumen für die PCR Von 5 μl bis 1 ml BAX 5 μl Roche 1 ml EHEC 1 ml

§ 3: Betriebseigene Kontrollen Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaft-lichen Lebensmittel-hygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern § 3: Betriebseigene Kontrollen (1) Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/2005 ...... oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.

Bifidobakterien – Methoden- vergleich Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert Methode KBE/g Kolonietypen Mikroskopie FTIR-Identifizierung RCM-Agar 37°C 1.000.000 3 groß, weiß mit glattem Rand = gezählte Kolonien kurze, unregelmäßige Stäbchen, kaum Verzweigungen, wenig keulenförmig -> uneindeutig bifid oder Lb? Bifidobacterium animalis sehr klein, durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand (v.a. auf VD <5) mittellange - lange Stb, KOH neg., Kat neg. -> Lb Lb. acidophilus im Hintergrund extrem kleine "nicht definierbare" pinpoints (v.a. auf VD <5) Streptokokken oder Laktobazillen ? nicht angewachsen, keine Identi möglich RCM-Agar 42°C viele keulenförmig, oft an einem Ende aufgetrieben wie "Glühbirnen" -> eindeutig bifid mittellange - lange Stb, KOH-, Kat- -> Lb TOS-MUP-Agar 1.400.000 (3) Agar-Oberfläche: groß, weiß, rund, glatter Rand im Agar: eher gelblich, linsenförmig, groß auf Plattenboden: groß, weiß mit durchscheinendem "flaumigem" Rand sehr große Zellen, meist stark verzweigt, viele Y-Formen -> eindeutig bifid alle 3 Kolonietypen Bifidobacterium animalis MRS-Agar 380.000 2 durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand lange Stäbchen 140.000 mittelgroß, weiß mit glattem Rand kurze Stäbchen in Ketten Lb.casei Bifidobakterien Laktob.

Bifidobakterien – Vergleichsunter-suchungen Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit-flora auf RCM-Agar Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%

Laktobazillen - Nachweis Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen -> KOH: negativ -> Katalase: negativ - Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g Identifizierung der Spezies: ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem „api 50 CH“ (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie

Grenzen der Mikrobiologie: fehlende Nachweismethode trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)

Bifidobakterien- Nachweis Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar: Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob (bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C) Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm Bestätigungstests: Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt. - KOH-Test: negativ (=grampositiv) Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Bifidobakterien- Nachweis Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen Inkubation: 72 ± 4 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie) Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt. - KOH-Test: negativ (=grampositiv) Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

Leistungs-potentiale Moderne Methoden : PCR: Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage Listerienanalyse ca. 2 Tage STEC ca. 2 Tage Cronobacter ca. 2 Tage FTIR Analyse: Absorption aller Zellbestandteile → Chemische Zusammensetzung des Keimes wird „dargestellt“ → definierte Wellenlängenbereiche werden für einen „Fingerabdruck“ des Keims ausgewertet

Bifidobakterien – Zusammen-fassung Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber: RCM-Agar 42°C TOS-MUP-Agar Kolonieform stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen (Gefahr der Falschzu- ordnung!) häufig sehr kleine Kolonien produktunabhängig 3 Kolonietypen entsprechend Lokalisation im Agar große, deutlich erkennbare Kolonien Mikroskopisches Bild oft rel. eindeutig als bifid zu erkennen (allerdings meist keulen- förmig, wenig Verzweigungen) teilweise fraglich bifid oder Laktobazillen -> weitere Differen- zierungen nötig absolut eindeutig meist große, deutlich keulen- förmige oder stark verzweigte Zellen Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken) meist stark vorhanden nicht vorhanden Eignung der Methode prinzipiell geeignet benötigt aber u.U. viel Differen- zierungsarbeit und methodische Erfahrung sehr gut geeignet keine weitere Differenzierung notwendig, mikroskopische Bestätigung reicht aus

Laktobazillen

Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele: Probenahme-planung Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele: Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005 „kritische“ Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel: Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien

Bifidobakterien - Kolonie-morphologie Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie RCM-Agar, 37°C, 72 Std. TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.