Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken VO 1

Studienplan VL jeweils Mi, 1130 Uhr bis inkl. 30.6.2010 Pflichtmodul 10: GL der mb Arbeitstechniken Biotechnologie Einführung in die Systematik der MO Vorraussetzung für: StPlan 2008: Pflichtmodul 11 StPlan 2003: Mikrob. GrundUE parallel zur VL Besuch der GrundUE möglich Zeugnis GrundUE nur mit Arbeitstechniken I Prüfung: Termine, am Ende der VL: 30.6.2010

Inhalt 1. Einführung 2. Sterilisation und Keimreduktion 3. Steriles Arbeiten 4. Kultivierung von MO‘s 5. Anreicherung und Isolierung 6. Aufbewahrung und Konservierung

Literatur Wallhäußer, K.H., 1995: Praxis der Sterilisation – Desinfektion – Konservierung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J., 2003: Brock Mikrobiologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Bast, E., 2001: Mikrobiologische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. Wistreich, G.A., 2003: Microbiology Laboratory – Fundamentals and Applications, Pearson Education, Upper Saddle River. Alexander, S.K., Strete, D., 2001: Mikrobiologisches Grundpraktikum, Pearson Education, München, Boston. Fuchs, G., Schlegel, H.G., 2007. Allgemeine Mikrobiologie, 8. Auflage, Thieme, Stuttgart, New York.

1. Einführung EinführungsVL, beschäftigt sich nur mit Grundlagen, die in anderen VLs vertieft werden Labormethoden Systematik Biochemie Angewandte Mibi Physiologie Arbeitstechniken II usw., usw., usw.

1. Einführung Mikrobiologie ganz allgemein beschäftigt sich mit lebenden Zellen und damit, wie diese ihre Aufgabe(n) erfüllen Eigenschaften lebender Zellen Fähigkeit zur Reproduktion Differenzierung Kommunikation Evolution

1. Einführung Grundelemente einer Zelle Proteine Lipide Nukleinsäuren Polysaccharide Mikrobiologie beschäftigt sich mit: Eukaryonten (Mikroalgen, Pilze, Protozoa) Prokaryonten (Bacteria, Archaea) Viren (als nicht selbstständig lebensfähige Teilchen ohne eigenen Stoffwechsel und eigene Reproduktionsfähigkeit)

1. Einführung Mo‘s unterscheiden sich von Pflanzen und Tieren v.a. durch geringere Größe und geringere morphologische Differenzierung Stoffwechselphysiologische Vielfalt Anpassungsfähigkeit hohe Stoffumsatzraten hohe Synthese- und Vermehrungsraten nahezu Allgegenwart weltweite Verbreitung

1. Einführung Größenvergleich (ca.): Protozoa: 1 bis 15 µm Pilze: 10 bis 15 µm Algen: ca. 30 µm Bakterien: 0,2 bis 10 µm Viren: noch eine Dimension kleiner

1. Einführung Robert Koch (*1843) Kochsche Postulate Pathogener MO in allen kranken Tieren vorhanden, fehlt aber in allen gensunden Kultivierung (Agarplatte) – Reinkultur gesundes Tier mit Reinkultur infizieren aus infiziertem Tier kann der pathogene Organismus wieder isoliert werden (Reinkultur)

1. Einführung Grundsätzliches: Zahlen: dt: Komma (16,46) engl: Punkt (16.46) mehrstellige Zahlen nicht mehr mit Komma (falsch: z.B. 53,360.265) sondern mit Leerzeichen (richtig: z.B. 53 360 265) trennen für große Zahlen Zehnerpotenzen verwenden: 53 360 265 wird zu: 5,34 * 107

1. Einführung Genauigkeit: richtet sich nach der Genauigkeit der verwendeten Messmethode Bei der Angabe von Ergebnissen sind soviel Stellen anzugeben, dass die vorletzte Stelle noch sicher, die letzte jedoch bereits als unsicher gilt. 16,46 43,236 59,696 ergibt 59,69 bei Rechnungen am Computer IMMER mit der exakten, niemals mit der gerundeten Zahl rechnen Zahlen „überschlagen“

1. Einführung Genauigkeit: :-( Zahlen „überschlagen“: auf einer Platten sind Bakterienkolonien zu sehen als Rechenergebnis kommen 10-6 Zellen pro Einheit heraus :-(

1. Einführung Mol: 1 Mol einer Substanz sind 6,022 x 1023 Moleküle dieser Substanz Avogadro: Teilchenzahl N pro Stoffmenge n Molar (M; mol/l): Mol einer Substanz in 1000ml Lösung → Masse pro Volumen Molal (mol / 1000 g Lm): Mol einer Substanz pro 1000g eines Lösungsmittels → Masse pro Masse Molverhältnis (mol %): Mol einer Substanz pro 100 ml eines Lösungsmittels

1. Einführung Masseprozent: weight per weight Gramm des gelösten Stoffes in 100 g Lösung Angabe: (w/w) Grammprozent: weight per volume Gramm des gelösten Stoffes in 100 ml Angabe (w/v) Beispiel: 10% (w/v) Glucose in A.d. Volumsprozent: volume per volume ml des gelösten Stoffes in 100 ml Lsg. Angabe (v/v) Beispiel: 10% (v/v) Acetonitril in A.d. oder: 10% (v/v) aqu. Acetonitril

1. Einführung Literatur zum Chemisch-Rechnen: Hillbrand U., 2007, Stöchiometrie. Springer, Berlin, Heidelberg. Wittenberg W., 2005, Rechnen in der Chemie, Grundoperationen, Stöchiometrie. 15. Auflage. Springer, Wein, New York. Pflichtmodul I

1. Einführung

1. Einführung Herstellung von 100 ml einer 50 mM KH2PO4 Lsg.: MKH2PO4 = 136,09 g/mol 0,68 g 100 ml-1 für eine 50 mM Lsg

1. Einführung Herstellung von 200 ml einer 1 M HCl Lsg. MHCl = 36,5 g/mol Konz. = 37% (w/v) Dichte = 1,19 37%ige HCl ist 12,06 molar 16,6 ml 37%ige HCl auf 200 ml

1. Einführung Herstellung von 10 ml einer 10%igen (w/v) Fleischextrakt Lsg. 1 g FE auf 10 ml A.dest. Herstellung von „molaren Lsgen“ (exakt) immer im Messkolben (z.B. 50 mM KH2PO4, 1 M HCl) „%-Lsgen“ (w/v, v/v) normalerweise auch im Messkolben (ABER: Fragestellung beachten!!!)

2. Sterilisation und Keimreduktion Mo‘s sind ubiquitär Arbeitsgeräte müssen frei von allen lebenden bzw. vermehrungsfähigen Mo‘s (steril) sein Nährmedien müssen steril sein Kontaminationen (Einschleppung von unerwünschten Mo‘s) müssen ferngehalten werden = steriles Arbeiten

2. Sterilisation und Keimreduktion Def. steril bzw. keimfrei: Def.: frei von vermehrungsfreien Mo‘s frei von Ruhestadien und Dauerformen (z. B. Sporen) Def. Sterilisation: Beseitigung und/oder Abtötung aller Mo‘s Inaktivierung von Viren die abgetöteten Keime verbleiben im Medium Def. Desinfektion: selektive Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung aller krankheitserregender Keime an und in kontaminierten Objekten steril/ teilweise steril/ unsteril

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze beruht v.a. auf der Denaturierung von Proteinen (Zellproteinen) bei trockener Hitze auf der Oxidation intrazellulärer Bestandteile Mo‘s verschieden anfällig für beide Varianten Wirkung abhängig von: Art des Mo‘s Alter Zustand (vegetative Zelle oder Spore) Umwelt- bzw. Milieubedingungen (Nährstoffe, pH,…) Ausgangskeimzahl ABER NICHT von: Form der Mo, Größe, NS, …

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze Wirkungsgradevaluation durch D-Wert Bestimmung Def. D-Wert (dezimale Reduktionszeit) : Zeit, die erforderlich ist, um unter genau festgelegten Bedingungen die Ausgangskeimzahl um eine Zehnerpotenz (d.h. um 90%) zu reduzieren. vegetative Zellen werden durch Hitze relativ leicht abgetötet Endosporenbildner (Bacillus, Clostridium) hitzeresistent Bei der Arbeit mit gemischten Populationen muss immer von den resistentesten Formen ausgegangen werden

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.1. Dampfsterilisation (Autoklavieren) Autoklavieren sicherste Sterilisationsmethode Einwirkung von gespanntem, gesättigtem Wasserdampf Normalerweise 121 °C, 2 bar Dampfdruck Angaben für die notwendige Autoklavierzeit schwanken zwischen 10 bis 15 min, 15 min, und 20 min Autoklavierzeit vom Medium abhängig (Empfindlichkeit), wenn möglich immer 20 min ergo: Mindestautoklavierzeit 20 min Häufig Medientemperatursteuerung Aufheiz- und Abkühlzeiten beachten (tw. bis 1 – 1,5 Stunden) Autoklaven-abhängig: verschiedene Programme: „Müll“, Flüssigkeiten, Geräte

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze Autoklaventypen: Vertikalautoklaven (Standgeräte) mit 60 bis 200 l Topfautoklaven 10 bis 40 l Horizontalautoklaven 10 bis 1000 l Verlauf der Dampfsterilisation: Aufheizzeit Steigzeit Ausgleichzeit (Temperaturfühler in Referenzgefäß) Sterilisierzeit (i.d.R. 20 min) Abkühlzeit

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze Kontrolle der Dampfsterilisation chemische Indikatoren: funktionieren meist über Thermoindikatoren, die man auf das Sterilgut aufklebt; mittels Verfärbung kann man das Einwirken einer bestimmten Temp. ablesen (nicht aber die EW Zeit) Bioindikatoren: meist Sporenstreifen in Ampullen, die an der kältesten Stelle im Autoklaven (hinten unten) angebracht werden und nach der Sterilisation in eine Nährlsg. unter sterilen Bedingungen überführt werden.

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.2. Tyndallisieren fraktionierte Sterilisation genannt mehrfaches (3x) Erhitzen auf 80 bis 100 °C meist im Wassertopf – Aufbewahrung bei Raumtemp. – Auskeimen von Endosporen – erneutes Erhitzen umständlich, zeitraubend zweifelhafter Erfolg

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze 2.1.3. Kochen, strömender Dampf zur Teilentkeimung (Desinfektionsverfahren) Einwirkung von 100 °C z.B. 5 minütiges Kochen von Gerätschaften z.B. 30 minütiges Kochen von NL: es werden nur vegetative Zellen abgetötet, keine Endosporen beispielsweise für die Herstellung von Kulturmedien für Anaerobier verwendet

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze trockene Luft ist ein schlechter Hitzeleiter Nachteile: bei trockener Hitze sind deutlich längere Einwirkzeiten und höhere Temperaturen notwendig nur begrenzt einsetzbar: nicht für Flüssigkeiten Vorteile: einfach unaufwändig keine nachträgliche Trocknung notwendig

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze 2.2.1. Heißluftsterilisation Temp./Zeit: 160 °C 180 min 170 °C 120 min 180 °C 30 min Einpacken in Alufolie geeignet für: Geräte aus Metall Glaswaren Gegenstände, die keine Feuchtigkeit vertragen

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze

2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze Kontrolle: durch chemische Indikatoren (Thermoindikatoren) durch Bioindikatoren als Teststreifen oder Indikatorbänder