Arbeitsanweisungen zur Durchführung des DNA-Fingerprinting-Experiments

1. Ansetzen der Restriktion

1.1 Beschriften der Tubes DNA [µl] 10 10 10 10 10 10 Beschriftung TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5 DNA [µl] 10 10 10 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 - V5)

1.2 Zugabe von 10 µl Enzymmix Enzymmix (E) [µl] 10 10 10 10 10 10 TO V 1 V 2 V 3 V 4 V5 Enzymmix (E) [µl] 10 10 10 10 10 10 Tubes enthalten bereits 10 µl der jeweiligen DNA von: grün (Tatort: TO), blau, orange, violett, rot und gelb (Verdächtige: V1 – V5) 4 4

2. Restriktionsverdau 20 Minuten bei 37 oC im Thermoblock Modell:

3. Während des Restriktionsverdaus Elektrophorese vorbereiten

3.1 Vorbereiten der Kammer Einsetzen des Schlittens, der Metallkeile und des Kamms in die Elektrophoresekammer

3.2 Herstellen des Agarosegels (0,8%) 0,24 g Agarose (AG) + 30 ml TAE-Puffer (1x) Gemisch in der Mikrowelle kurz aufkochen, umschwenken und erneut kurz zum Kochen bringen Gel muss schlierenfrei sein!

3.3 Befüllen der Gelkammer Gel auf ca. 55 oC abkühlen lassen (Handrückentest) und gießen Achtung: Kammer bis zum Erstarren des Gels nicht mehr bewegen Abb.: Gießen des Agarose- gels in die Kammer

3.3 Befüllen der Gelkammer Nach Erstarren des Gels, Metallkeile entfernen Gel mit ca. 270 ml TAE- Puffer (1x) überschichten Kamm ziehen Achtung: die Taschen müssen frei von Luftblasen sein

4. Vorbereiten des Längenstandards Zu 10 µl Längen-standard (M) werden 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert Inhalt (20 µl) gut ver-mischen M

5. Zugabe des Ladepuffers In die Tubes TO und V1 – V5 werden jeweils 10 µl Ladepuffer (LP) pipettiert Inhalt (30 µl) gut ver-mischen 10 µl 10 µl 10 µl

6. Füllen der Geltaschen Linke Randspur bleibt frei Je 20 µl der Proben TO und V1 – V5 bzw. 20 µl Längen-standard (M) in jeweils eine Geltasche pipettieren Reihenfolge beachten!!! Spuren: von links nach rechts

6. Füllen der Geltaschen Achtung: Geltasche darf dabei nicht durchstoßen werden

7. Gelelektrophorese Spannung: 180 V Modell: Verschließen der Elektrophorese-kammer: Kathode (-) nahe den Geltaschen Anode (+) gegenüber Spannung: 180 V Modell:

8. Färben der DNA Entnahme des Gelschlittens aus der Elektrophoresekammer Gel in Färbeschale überführen und mit 100 ml Färbelösung (50x) für 2 Minuten färben Färbelösung abgießen (kann wieder verwendet werden) Entfärben des Gels durch zweimaliges Wässern in 45 oC warmen Wasser

9. Ergebnis der Gelelektrophorese TO V1 V2 V3 V4 V5 M 9. Ergebnis der Gelelektrophorese Wer ist der Täter ?