Einführung: GC und HPLC Chromatographie 2 Einführung: GC und HPLC

Gaschromatographie (GC) Grundlage ist die Verteilung des Analyten zwischen einer gasförmigen mobilen und einer flüssigen stationären Phase

Stationäre Phase GC Eigenschaften - Geringe Flüchtigkeit (hoher Siedepunkt >400 °C) - Thermische Stabilität - Chemische Inertheit Immobilisierte Flüßigkeiten Polarität ausschlaggebend; meist hochsiedende Silikonöle DB-1, HP-1, CP-1 = Polydimethylsiloxan (unpolar) DB-5= Poly(phenylmethyl)dimethylsiloxan (5% Phenyl) Carbowax = Polyethylenglycol (polarer)

Trennsäulen GC Gepackte Säulen ca. 2 m lange Glassäulen; Innen-Ø 2 mm Trägermaterial (z.B. Kieselgur, Ø 150-250 µm) Stationäre Phase als Film auf Träger (0.05 - 1 µm) Kapillarsäulen Quarzsäulen mit Polyimidbeschichtung (flexibel!) 10 - 100 m lang; Innen-Ø von 0.1 - 0.5 mm Stationäre Phase als Film an der Kapillare (FSOT) Filmdicke 0.01 - 5 µm

Mobile Phase GC Mobile Phase tritt nicht mit dem Analyten in Wechselwirkung, sondern sorgt nur für den Transport des Analyten durch die Säule ! Eigenschaften Inertes Gas (H2, He, N2); sauerstofffrei Flußraten (Kapillarsäulen) Massefluß: 0.5 - 2.0 mL min-1 Lineare Strömungsgeschwindigkeit (µ) 5 - 40 cm s-1

Mobile Phase & Trennung GC Einfluß der Fließgeschwindigkeit auf die Trennung (Bandenverbreiterung) van Deemter

Massentransferkoeffizient (C) van Deemter Gleichung GC Massentransferkoeffizient (C) Diffusionskontrolierter Massetransfer zwischen stationären und mobiler Phase. Linear von der Geschwindigkeit abhängig Die in der mobilen Phase befindlichen Moleküle wandern weiter, während sich jene die aus der stationären Phase zurückkehren nur verzögert in die Bande eingleidern können  Bandenverbreiterung

van Deemter Gleichung GC Eddy-Diffusion (A) Streudiffusion aufgrund ungleicher Substanzwanderung. Geschwindigkeitunabhängige Komponente

Longitudinal-Diffusion (B) van Deemter Gleichung GC Longitudinal-Diffusion (B) Diffusion entlang der Längsachse der Säule (in Flußrichtung) Komponente nimmt mit zunehmender Geschwingigkeit ab.

van Deemter Gleichung GC H = A + + C . µ B µ C A B

Trägergasversorgung GC Druckregelung Trägergasflüsse Säulenvordruck wird eingestellt (column head pressure) ca. 20-150 hPa Durchflußmessung mittels Blasenzähler am Ende der Säule Trägergasflüsse Wenn Temperatur gesteigert wird, fällt bei gleichbleiben-den Druck die lineare Ge-schwindigkeit! Abhilfe schafft eine elektronische Druckregelung, die die lineare Geschwindig-keit konstant hält.

Injektor GC Injektor: Probenaufgabe Probengeber Einspritzvolumen so klein als möglich (0.5-1 µL) „on-column injector“ (direkte Einspritzung) „split/splitless injector“ (indirekte Einspritzung) Insert Probengeber

Gasversorgung & Injektor GC

Split/Splitless-Injektor GC

Temperatur & Säulenofen GC 45° Säulentemperatur Wichtige Variable! Elutionstemperatur muß höher sein als die Siede-temperatur des Analyten Proben unterschiedlicher Siedetemperatur werden mit einem Temperaturprogramm aufgetrennt Säulenofen zur Thermo-statierung (kontinuierliche T-Erhöhung) 145° 35-180°

Detektoren GC Eigenschaften Arten von Detektoren Ausreichende Empfindlichkeit Gute Stabilität Gute Reproduzierbarkeit Großer linarer Bereich Schnelle Ansprechzeiten Selektivität Hoher Temperaturbereich Arten von Detektoren FID (Flammenionisations- detektor) TCD (Wärmeleitfähigkeits-detektor) ECD (Elktroneneinfang-detektor) AED (Atomemissionsdetektor) GC-MS (Kopplung zu einem Massenspektrometer)

Flammenionisations-Detektor GC

GC-MS Kopplung GC

GC-MS Chromatogram GC

Derivatisierung GC Viele polare organische Moleküle sind nicht verflüchtigbar! Derivatisierung: chemische Modifizierung, die die Analyte flüchtig(er) macht und gleichzeitig bei hohen Temperaturen stabilisiert Häufig Methylierungen (z.B. Trimethylsilyl-Derivate) Silylierung Übertragung einer TMSi-Gruppe [-Si(CH3) 3] auf funktionelle Gruppen: - OH - COOH - NH2 - SH Silylierung muß im wasser-freien Milleu erfolgen! Pyridin + BSTFA + TMCS

HPLC MW 102 103 104 105 106 Verteilung Adsorption Ionenaus- tausch RP NP 103 104 Ausschluß 105 Permeation Gelfiltration 106 Wasserunlöslich (unpolar) Wasserlöslich (polar, ionisch)

HPLC

Verteilungschromatographie HPLC Verteilungschromatographie Trennung nach POLARITÄT! (Flüßig-Flüßig-Chromatographie oder) Chromatographie an chemisch gebundenen Phasen Stationäre Phasen: Silikagele (3-10 µm) modifiziert mit z.B. C18 (ODS), C4 -, Aminogruppen Silikagel ODS R

„Reversed Phase“ HPLC Polarität: A > B > C t t Normalphasen polare stationäre Phase + unpolare mobile Phase (z.B. Aluminiumoxid/H2O + Hexan) Umkehrphasen (Reversed Phase) unpolare stationäre Phase + polares Lösungsmittel (z.B. ODS + Methanol/Acetonitril) Polarität: A > B > C C B A t A B C t

Adsorptionschromatographie HPLC Adsorptionschromatographie Kieselgele oder Aluminiumoxide als stationäre Phasen Zur Trennung kann nur die Polarität der mobilen Phase geändert werden Als Ergänzung zur Verteilungschromatographie, wenn Substanzen stark unpolar sind (in polaren Lösungs-mitteln schwer löslich sind) Sehr gut für Isomeren-Trennung geeignet

Ionenchromatographie HPLC Ionenchromatographie Stationäre Phasen sind Ionenaustauscher (meist Kunstharze auf Polystyrenbasis) mit immobilisierten geladenen funktionellen Gruppen: Anionenaustauscher: [ — N(CH3)3+ OH-] Kationenaustauscher: [ — SO3- H+] Mobile Phasen sind Elektrolyte Niedrigkonzentrierte Salzlösungen,Säuren oder Basen Elution erfolgt entweder durch Erhöhung der Ionenstärke oder durch pH-Änderung!

Supressortechnik HPLC Problem in der Ionenchromatographie: Eigenleitfähigkeit des Eluenten

Anwendungen der Ionenchromatographie HPLC Anwendungen der Ionenchromatographie Auftrennung von organischen und anorganische Ionen (insbesondere von Anionen, für die nur wenige verläßliche Trennmethoden existieren) Bestimmung von Kohlenhydraten an Anionentauschern (KH sind im alkalischen Millieu geladen!) Bestimmung von Aminosäuren an Kationentauschern (Aminosäuren sind amphotere Substanzen und im liegen unterhalb von pH=6 vollständig als Kationen vor) Wichtige Methode bei der Trennung von Proteinen (AEC an schwachen Anionenaustauschern)

Auschlußchromatographie HPLC Auschlußchromatographie Poröse stationäre Phase (z.B. Polymerteilchen) Mobile Phase kommt in 2 Formen vor: fließend, zwischen den Teilchen stagnierend, in den Poren Analyte werden je nach Größe in die Poren der stationären Phase eindringen können, oder werden vom Poren ausgeschlossen.

HPLC Das HPLC-System Trennsäule Pumpe Detektor Eluent Einspritzventil

HPLC Injektoren Rheodyne

Detektoren Nachweisgrenzen UV-Vis Detektor 1 ng HPLC Detektoren Nachweisgrenzen UV-Vis Detektor 1 ng Diodenarray-Detektoren 1 ng Brechungsindex-Detektor (RI) 1 µg Elektrochemischer Detektor (AD, PAD) 10 pg Leitfähigkeitsdetektor (CD) 1 ng Fluoreszenz-Detektoren 10 pg Lichtstreu-Detektor 10 µg HPLC-MS Kopplung 1 ng