1 Standardisierung und Etablierung einer in vitro- Methode zur Schätzung der Phosphorverdaulichkeit beim Schwein D. Petri, Saskia Kehraus, K.-H. Südekum Institut für Tierwissenschaften Universität Bonn 119. VDLUFA-Kongress, Göttingen, September 2007

2 1. Einleitung

3 P-Bewertung von Futtermitteln beim Schwein Europa: P-Bewertung nach dem System des verdaulichen Phosphors (vP) Differenz-Fütterungsversuche bei P- Knappheit in der Ration (GfE, 1994) Analytische Bestimmung des Gesamt-P- Gehalts in Futtermitteln und Kot vP = Differenz Aufnahme - Ausscheidung im Kot (%) Große Genauigkeit bei hohem Aufwand

4 P-Bewertung von Futtermitteln beim Schwein Nordamerika: P-Bewertung nach dem System des bioverfügbaren Phosphors (aP) Differenz-Fütterungsversuche bei P- Knappheit, als Referenzgröße dient eine hochverdauliche P-Quelle (z. B. Mono- Natriumphosphat) Analytische Bestimmung des Gesamt-P Bestimmung des Mineralisierungsgrads der Knochen (Bruchfestigkeit/Rohasche-Gehalt) aP wird angegeben in % des Gesamt-P- Gehalts

5 In vitro „Test Tube“(TT)-Methode BOLLINGER et al. entwickelten 2004 eine in vitro-Methode zur Schätzung des aP-Gehalts Nach drei enzymatischen Verdauungsstufen, die die Verdauung des Schweins nach- empfinden, wird der Gehalt an hydrolysiertem P aus dem Futtermittel photometrisch gemessen Enzymkonzentrationen, Dauer der Enzym- behandlung und die Einwaagemenge wurden mit Hilfe einer vollständig randomisierten ANOVA getestet

6 2. Standardisierung der Methode

7 Überlegungen In vitro-TT-Methode nach BOLLINGER et al. (2004) simuliert die Verdauung im Schwein Korrelation mit Ergebnissen aus Fütterungsversuchen zur vP-Bestimmung GfE (1997): Methode zur in vitro-vP- Schätzung wünschenswert, da Aufwand für Fütterungsversuche sehr hoch und Datenbasis der Empfehlungen relativ schmal

8 Rekonstruktion und Weiter- entwicklung der TT-Methode Das von BOLLINGER et al. verwendete Produkt Natugrain ® wird nicht mehr produziert: Nachfolgeprodukt Natugrain ® TS (NatTS) Die Angaben zur photometrischen Messung waren ungenau (BOLLINGER et al. 2004, 2005) Evaluierung der in vitro-Methode an 5 in vivo geprüften Erbsensorten (KLUTH et al. 2004) sowie reinem Na-Phytat und minerali- schem Mono-Na-Phosphat

9 Einwaage Einwaage von 250,0 mg ± 0,2 mg

10 Enzymatische Verdauung Vorverdauung: 3 ml 0,04%-ige NaN 3 -Lösung mit 5,3 mg/ml NatTS NatTS: Endo-Xylanase und Endo- β -Glucanase Erhöht die Kohlenhydratverdaulichkeit, beugt Gelbildung vor Pepsinverdauung: 1 ml 0,85 N HCl-Lösung mit U/ml porcinem Pepsin Endopeptidase: Proteine  Peptide, Freisetzung des P aus der Matrix, Simulation des Magens des Schweins Pankreatinverdauung: 1,3 ml 0,8 M NaHCO 3 -Lsg. mit 22,6 mg/ml porcinem Pankreatin Enzymgemisch (Amylasen, Proteasen, Lipasen) aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins, Simulation des Dünndarms (Schüttelwasserbad bei 39 °C, 120 rpm, 1 [Vorverdauung] bzw. 2 h)

11 Verdauungsstopp Eiswasserbad (reversibel) 20 ml 2 N HCl (irreversibel)

12 Zentrifugation, Färbung & photometrische Messung Zentrifugation bei 1000 x g (20 min) Aliquot: ml aus dem klaren Überstand Anfärben des hydrolysierten P mit Hilfe von Vanadium-Molybdat-Komplexierung Auffüllen auf 50 ml Zentrifugation bei 3000 x g (5 min) Photometrische Messung bei 415 nm

13 3. Ergebnisse

14 P-Verdaulichkeitskoeffizienten In vitro In vivo (Literatur) n P (g/kg TM) nvPSDvPSD NaPhyt Erbsensorte Avia Laser Madonna Miami Swing MNaP TM, Trockenmasse; vP, Verdaulichkeitskoeffizient für Phosphor; SD, Standardabweichung

15 Lineare Beziehung: Verdaulicher P (vP) in vitro versus in vivo Lineare Regression (p > 0.95 Konfidenzintervall): Y in vivo = (1.288 ± 0.215) * X in vitro + ( ± ); R² = 0.878, r = vP in vivo vP in vitro A Na-Phytat B Avia C Laser D Madonna E Miami F Swing G Mono-Na- Phosphat

16 4. Diskussion der Methode

17 Stärken Im Gegensatz zum Fütterungsversuch: Schnell, effizient, kostengünstig Trotz geringer Anzahl der zur Evaluierung zur Verfügung stehenden in vivo-vP-Proben enge Korrelation in vivo zu in vitro ( r = 0,937) Ausreichende Wiederholbarkeiten zwischen den Bestimmungen (relative Ø Standardab- weichung über alle Analysen und Bestimmungen: 5,6 %)

18 Schwächen Für eine analytische Methode (zu) aufwendig, fehleranfällig und zeitintensiv Hohe Ausschussquote: vor allem Schwebe-- teilchen verfälschen bei der photometri- schen Messung sehr schnell das Messer- gebnis Keine Unterbrechungsmöglichkeiten während der Bestimmung

19 Weiterentwicklung Anpassung der Einwaage an den vermuteten Gehalt an vP Mischung der Enzymlösungen mit dem Probenmaterial verbessern Vermeidung von Schwebeteilchen in der Messlösung: Filtration, mehr 2N HCl zugeben, schneller Zentrifugieren

20 5. Anwendung

21 Schätzung des vP von Getreide- schlempe (getrocknet) Getreideschlempe: ProtiGrain ® als Koppelprodukt der Bioethanolherstellung Es besteht aus etwa 10 % Gerste und 90 % Weizen Analysen an ProtiGrain ®, Weizen, Gerste

22 P-Verdaulichkeiten In vitro In vivo (Schätzung) In vivo (Literatur) n P (g/kg TM) nvPSDvPSDvP ProtiGrain ® Wheat ± 0.06 Barley ± 0.11 TM, Trockenmasse; vP, Verdaulichkeitskoeffizient für Phosphor; SD, Standardabweichung

23 6. Fazit In vitro-Methode zur Schätzung der P- Verdaulichkeit beim Schwein etabliert, standardisiert und angewendet Bestimmtheitsmaß der linearen Regression zwischen in vitro- und in vivo-Verdaulich- keiten des P von 88 % Bisher wenig Vergleichsmaterial in vivo Gehalte an vP in Futtermitteln für Schweine schnell und genau bestimmen Sicherheitszuschläge bei der vP-Bewertung abbauen und die Datengrundlage erweitern

24 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!