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Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff.

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1 Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff. Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter: http://www.iib.unibe.ch/wiki/?p=teaching/medical_students&l=de

2 KV 8.22 KV2 im Überblick Was sind Immunassays? Was versteckt sich hinter den Abkürzungen? Assay Beispiele um immunologische Prinzipien zu vertiefen Aussagekraft von Labordaten Vertrauensgrenzen Lernziele: Immunologie in der Labormedizin

3 KV 8.23 Was ankreuzen?

4 Selbststudium: de.wikipedia.org/wiki/Immunoassay Allgemeine Grundlagen Analyt Detektionstechniken Feste Phase Quantifizierung Assay-Prinzipien Kompetitiver Assay Nicht-kompetitiver Assay Direkter Assay KV 8.24

5 5 KV2 im Überblick Präzipitationsteste Agglutinations Teste Antigen-Antikörper Teste Allgemein Allergie Diagnostik Flowzytometrie HLA Diagnostik Autoimmun Diagnostik Sensitivität und Spezifität von Labortesten Immunologie in der Labormedizin

6 KV 8.26 Identität 1 A 4 2 3 6 5 Partielle Identität 1 A 4 2 3 6 5 Keine Identität 1 A 4 2 3 6 5 Immunodiffusion (Ouchterlony Gel) A 1 2 Antigen Kontrollserum Testserum

7 KV 8.27 Antigen Präzipitinkurve + Anti-A Anti-B Anti-C C B A AntikörperImmunkomplex Antigen ProzonePostzone Äquivalenz

8 KV 8.28 Radiale Immunodiffusion Antigen Konzentration Diameter 2 Ag Antikörper im Gel

9 KV 8.29 Serum Elektrophorese gamma beta alpha2 alpha1 Albumin - + Globuline Paraproteinämie-Patient

10 KV 8.210 Immun-Elektrophorese IgAAlbuminTransferrinIgGIgM + Normales Serum Patienetenserum mit IgA Mangel Antikörper gegen Serumproteine - Beispiel

11 KV 8.211 Direkter Coombs Test

12 KV 8.212 Der indirekte Coombs Test Patienten Serum Erythrozyten + Step 1 + Coombs Reagens (Antiglobulin) Step 2 z.B. anti-RhD Antikörper

13 KV 8.213 Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)

14 KV 8.214 Latex Agglutination

15 KV 8.215 Blutgruppenbestimmung: Geltechnik Resultat: Blutgruppe A RhD neg monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A Antigen in der oberen Gelmatrix

16 KV 8.216 z.B. Schwangerschaftstest rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase) Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)

17 KV 8.217 Allergieserologie: welcher Test? Anti- 2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISAU/ml<15 Cardiolipin-Antikörper (IgG)SYNELISAGPL-U/ml<12 ECP ("eosinophil cationic protein")FEIA g/L 2.5-15 TryptaseFEIA g/L 1-13.5 MethylhistaminRIAµg/g Kreatinin70-160 Total IgEFEIAkIU/L(altersabhängig) Allergen-spezifisches IgE (RAST) FEIARastklassen 0-60 Allergen-spezifisches IgGFEIAmg/L< 50 mg/L PräzipitineImmundiffusionqualitativnegativ AnalyseMessprinzipMasseinheit Referenz- bereich

18 KV 8.218

19 KV 8.219 Isotop Enzyme Messung der RadioaktivitätoderEnzymaktivität Immun Assay: RIA & ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay AntikörperAntigen markierterAntikörper Radio Immuno Assay

20 KV 8.220 ELISA Anti-A Markierter Antikörper A Enzym Substrat Produkt

21 KV 8.221 Sandwich ELISA Anti-A Anti-Antikörper A Enzym Substrat Produkt

22 KV 8.222 Standardisierung

23 KV 8.223 Beispiel: Flowzytometrie Analyse MessprinzipMasseinheitReferenzbereich HLA-B27 Zytofluorometrie qualitativ positiv/negativ Lymphozyten Zytofluorometrie Zellen/ l 1200-2800 CD3 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten 690-2540 55-84 CD4 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten 410-1590 31-60 CD8 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten 190-1140 13-41 NK-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten 90-590 5-27 B-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten 90-660 6-25

24 KV 8.224 sample red fluorescence sorted cells sheet flow nozzle laser forward scatter right angle scatter green fluorescence prism FACS Fluorescence Activated Cell Sorter Fluorescence Activated Cell Sorter

25 KV 8.225 Zellpopulationen ?

26 KV 8.226 CD-Antikörper CD Antigen FunktionVorkommen CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten, Signaltransduktion reife T-Lymphozyten CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Molekülezytotoxische T-Lymphozyten CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin (LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen, Makrophagen CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgEB-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC) CD 25 Interleukin-2-Rezeptoraktivierte T-Lymphozyten IgM Antigenrezeptorunreife + reife B-Lymphos IgD Antigenrezeptorreife B-Lymphos HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von Antigenpeptiden AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos

27 KV 8.227 Eine Immunantwort verfolgen

28 KV 8.228 CD-Marker bei der Diagnose von lymphohämopoietischen Erkrankungen StammzellePrä-B.frühe B.mittlere B.reife B.plasmozytoide B.Plasmazelle ALL PLL, Burkitt Lymphom CLL, foll. L. Haarzell- L. WaldenströmMyelom CD19 CD 20 CD 34 CD 52 CD138

29 KV 8.229 Beispiel: HLA Typisierung

30 KV 8.230 HLA Typisierung einst...

31 KV 8.231 Überlebensrate Nierentransplantate Number of HLA mismatches A & B DQ & DR 0 0 A & B DQ & DR 3 or 4 1 or 2

32 KV 8.232 HLA-B27 Typisierung mittels FACS

33 KV 8.233 HLA Typisierung serologisch

34 KV 8.234 PCR

35 KV 8.235 HLA: Molekulare Diagnostik

36 KV 8.236 Array Technologie DNA Chips

37 KV 8.237 Western Blot: Prinzip

38 KV 8.238 HIV: Western Blot 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C

39 KV 8.239 Beispiel: Autoimmunserologie Analyse Messprinzip MasseinheitReferenzbereich RheumafaktorNephelometrieIU/ml< 20 Zellkerne (ANA)IIFTiter< 1:80 Thyreoidea ThyroglobulinAgglutinationTiter< 1:400 C1-Esteraseinhibitor (funktionell) Fotometrie% des Normwertes 70-130% C1q-tragende ImmunkomplexeELISA g/ml < 35 HautbiopsieDIFqualitativnegativ SchleimhautbiopsieDIFqualitativnegativ

40 KV 8.240 Nephelometry

41 KV 8.241 Immunfluoreszenz Antinukleäre Antikörper (ANA) Ag Fluorochrom markierter AK Gewebe

42 KV 8.242 In situ Hybridisierung

43 KV 8.243 FISH

44 KV 8.244 FISH Beispiel Fluorescent in situ hybridisation of a small intestinal biopsy in a case of Whipple's disease (confocal laser scanning microscopy). Tropheryma whipplei rRNA is blue, nuclei of human cells are green and the intracellular cytoskeletal protein vimentin is red. Magnification approximately 200 x.

45 KV 8.245 Immunhistochemie Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)

46 KV 8.246 Sensitivität und Spezifität Sensitivität (epidemiologisch) Sensitivität (analytisch) niedriger Titer Serokonversion Verdünnung

47 KV 8.247 oder... Sensitivität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei kranken Personen positiv ausfällt Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei gesunden Personen negativ ausfällt

48 KV 8.248 Genauigkeit der Labordiagnostik X 100% Anzahl richtig positiver (Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer) Sensitivität = X 100% Spezifität = Anzahl richtig negativer Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver

49 Beispiel Tatsächlicher Sachverhalt positiv (krank) negativ (gesund) Gesamt Testergebnis positiv (krank) richtig positiv 95 falsch positiv 30125 negativ (gesund) falsch negativ 5 richtig negativ 270275 Gesamt100300400 KV 8.249 Sensitivität: 95 % Spezifität: 90 %

50 KV 8.250 Aussagekraft der Labordiagnostik echt Positive + falsch Positive echt Positive X 100% positiver prädiktiver Wert = echt Negative + falsch Negative echt Negative X 100% negativer prädiktiver Wert =

51 HIV Testung bei der Gesamtbevölkerung (82Mio) HIV positivHIV negativ HIV-Test positiv 66 93382 000148 933 HIV-Test negativ 67 ca. 82 Mio Summe 82 Mio KV 8.251 Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9% positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %!

52 KV 8.252 KV2 im Rückblick Immunologie in der Labormedizin Traditionelle Serologie Moderne immunologische Teste Molekularbiologische Methoden Outlook: Point-of-care testing ? Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004 Ein Einblick in die Labormedizin http://www.immunology.unibe.ch/wiki/?p=teaching/medical_students/practicle&l=de


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