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Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff.

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1 Immunologie in der Labormedizin Konteptvorlesung 2 Themenblock 8 Beda M. Stadler Einige der Folien werden als Illustration verwendet und sind nicht Lernstoff. Sie sind so wie hier entweder orange unterlegt oder umrandet Diese Folien stehen auch als PPT Files zum download bereit unter:

2 KV 8.22 KV2 im Überblick Was sind Immunassays? Was versteckt sich hinter den Abkürzungen? Assay Beispiele um immunologische Prinzipien zu vertiefen Aussagekraft von Labordaten Vertrauensgrenzen Lernziele: Immunologie in der Labormedizin

3 KV 8.23 Was ankreuzen?

4 Selbststudium: de.wikipedia.org/wiki/Immunoassay Allgemeine Grundlagen Analyt Detektionstechniken Feste Phase Quantifizierung Assay-Prinzipien Kompetitiver Assay Nicht-kompetitiver Assay Direkter Assay KV 8.24

5 5 KV2 im Überblick Präzipitationsteste Agglutinations Teste Antigen-Antikörper Teste Allgemein Allergie Diagnostik Flowzytometrie HLA Diagnostik Autoimmun Diagnostik Sensitivität und Spezifität von Labortesten Immunologie in der Labormedizin

6 KV 8.26 Identität 1 A Partielle Identität 1 A Keine Identität 1 A Immunodiffusion (Ouchterlony Gel) A 1 2 Antigen Kontrollserum Testserum

7 KV 8.27 Antigen Präzipitinkurve + Anti-A Anti-B Anti-C C B A AntikörperImmunkomplex Antigen ProzonePostzone Äquivalenz

8 KV 8.28 Radiale Immunodiffusion Antigen Konzentration Diameter 2 Ag Antikörper im Gel

9 KV 8.29 Serum Elektrophorese gamma beta alpha2 alpha1 Albumin - + Globuline Paraproteinämie-Patient

10 KV Immun-Elektrophorese IgAAlbuminTransferrinIgGIgM + Normales Serum Patienetenserum mit IgA Mangel Antikörper gegen Serumproteine - Beispiel

11 KV Direkter Coombs Test

12 KV Der indirekte Coombs Test Patienten Serum Erythrozyten + Step 1 + Coombs Reagens (Antiglobulin) Step 2 z.B. anti-RhD Antikörper

13 KV Passive Hämagglutination (Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)

14 KV Latex Agglutination

15 KV Blutgruppenbestimmung: Geltechnik Resultat: Blutgruppe A RhD neg monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A Antigen in der oberen Gelmatrix

16 KV z.B. Schwangerschaftstest rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase) Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)

17 KV Allergieserologie: welcher Test? Anti- 2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISAU/ml<15 Cardiolipin-Antikörper (IgG)SYNELISAGPL-U/ml<12 ECP ("eosinophil cationic protein")FEIA g/L TryptaseFEIA g/L MethylhistaminRIAµg/g Kreatinin Total IgEFEIAkIU/L(altersabhängig) Allergen-spezifisches IgE (RAST) FEIARastklassen 0-60 Allergen-spezifisches IgGFEIAmg/L< 50 mg/L PräzipitineImmundiffusionqualitativnegativ AnalyseMessprinzipMasseinheit Referenz- bereich

18 KV 8.218

19 KV Isotop Enzyme Messung der RadioaktivitätoderEnzymaktivität Immun Assay: RIA & ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay AntikörperAntigen markierterAntikörper Radio Immuno Assay

20 KV ELISA Anti-A Markierter Antikörper A Enzym Substrat Produkt

21 KV Sandwich ELISA Anti-A Anti-Antikörper A Enzym Substrat Produkt

22 KV Standardisierung

23 KV Beispiel: Flowzytometrie Analyse MessprinzipMasseinheitReferenzbereich HLA-B27 Zytofluorometrie qualitativ positiv/negativ Lymphozyten Zytofluorometrie Zellen/ l CD3 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten CD4 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten CD8 absolut Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten NK-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten B-Zellen Zytofluorometrie Berechnung Zellen/ l % der Lymphozyten

24 KV sample red fluorescence sorted cells sheet flow nozzle laser forward scatter right angle scatter green fluorescence prism FACS Fluorescence Activated Cell Sorter Fluorescence Activated Cell Sorter

25 KV Zellpopulationen ?

26 KV CD-Antikörper CD Antigen FunktionVorkommen CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten, Signaltransduktion reife T-Lymphozyten CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Molekülezytotoxische T-Lymphozyten CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin (LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen, Makrophagen CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgEB-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC) CD 25 Interleukin-2-Rezeptoraktivierte T-Lymphozyten IgM Antigenrezeptorunreife + reife B-Lymphos IgD Antigenrezeptorreife B-Lymphos HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von Antigenpeptiden AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos

27 KV Eine Immunantwort verfolgen

28 KV CD-Marker bei der Diagnose von lymphohämopoietischen Erkrankungen StammzellePrä-B.frühe B.mittlere B.reife B.plasmozytoide B.Plasmazelle ALL PLL, Burkitt Lymphom CLL, foll. L. Haarzell- L. WaldenströmMyelom CD19 CD 20 CD 34 CD 52 CD138

29 KV Beispiel: HLA Typisierung

30 KV HLA Typisierung einst...

31 KV Überlebensrate Nierentransplantate Number of HLA mismatches A & B DQ & DR 0 0 A & B DQ & DR 3 or 4 1 or 2

32 KV HLA-B27 Typisierung mittels FACS

33 KV HLA Typisierung serologisch

34 KV PCR

35 KV HLA: Molekulare Diagnostik

36 KV Array Technologie DNA Chips

37 KV Western Blot: Prinzip

38 KV HIV: Western Blot 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C 1.Lane 1, HIV+ serum (positive control) 2.Lane 2, HIV- serum (negative control) 3.Lane A, Patient A 4.Lane B, Patient B 5.Lane C, Patient C

39 KV Beispiel: Autoimmunserologie Analyse Messprinzip MasseinheitReferenzbereich RheumafaktorNephelometrieIU/ml< 20 Zellkerne (ANA)IIFTiter< 1:80 Thyreoidea ThyroglobulinAgglutinationTiter< 1:400 C1-Esteraseinhibitor (funktionell) Fotometrie% des Normwertes % C1q-tragende ImmunkomplexeELISA g/ml < 35 HautbiopsieDIFqualitativnegativ SchleimhautbiopsieDIFqualitativnegativ

40 KV Nephelometry

41 KV Immunfluoreszenz Antinukleäre Antikörper (ANA) Ag Fluorochrom markierter AK Gewebe

42 KV In situ Hybridisierung

43 KV FISH

44 KV FISH Beispiel Fluorescent in situ hybridisation of a small intestinal biopsy in a case of Whipple's disease (confocal laser scanning microscopy). Tropheryma whipplei rRNA is blue, nuclei of human cells are green and the intracellular cytoskeletal protein vimentin is red. Magnification approximately 200 x.

45 KV Immunhistochemie Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)

46 KV Sensitivität und Spezifität Sensitivität (epidemiologisch) Sensitivität (analytisch) niedriger Titer Serokonversion Verdünnung

47 KV oder... Sensitivität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei kranken Personen positiv ausfällt Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei gesunden Personen negativ ausfällt

48 KV Genauigkeit der Labordiagnostik X 100% Anzahl richtig positiver (Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer) Sensitivität = X 100% Spezifität = Anzahl richtig negativer Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver

49 Beispiel Tatsächlicher Sachverhalt positiv (krank) negativ (gesund) Gesamt Testergebnis positiv (krank) richtig positiv 95 falsch positiv negativ (gesund) falsch negativ 5 richtig negativ Gesamt KV Sensitivität: 95 % Spezifität: 90 %

50 KV Aussagekraft der Labordiagnostik echt Positive + falsch Positive echt Positive X 100% positiver prädiktiver Wert = echt Negative + falsch Negative echt Negative X 100% negativer prädiktiver Wert =

51 HIV Testung bei der Gesamtbevölkerung (82Mio) HIV positivHIV negativ HIV-Test positiv HIV-Test negativ 67 ca. 82 Mio Summe 82 Mio KV Falls Sensitivität und Spezifität = 99.9% positive Vorhersagewert beträgt nur 45 %!

52 KV KV2 im Rückblick Immunologie in der Labormedizin Traditionelle Serologie Moderne immunologische Teste Molekularbiologische Methoden Outlook: Point-of-care testing ? Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004 Ein Einblick in die Labormedizin


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