Translationsrichtung

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1 Translationsrichtung
Die Protein-Biosynthese wachsende Polypetid-Kette Ribosomen sind die protein-synthetisierenden Maschinen der Zelle 3´ 5´ mRNA Translationsrichtung

2 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

3 Aufbau der Ribosomen 40S Untereinheit 60S Untereinheit 80S Ribosom Jede menschliche Zelle besitzt ca. 1 Million Ribosomen (bei E. coli ca ). In Zusammenarbeit mit mRNA, tRNA und weiteren Proteinfaktoren koordinieren die Ribosomen die Proteinsynthese

4 Aufbau der Ribosomen Bakterien Eukaryonten 70S Ribosom 80S Ribosom 60S
2.5 MDa 80S Ribosom 4.2 MDa 60S 50S 40S 30S 40S

5 Ribosomen bauen sich aus rRNA und r-Proteinen auf
Bakterien 70S Ribosom 2.5 MDa 50S 23S rRNA (3200 Nt) 5S rRNA (120 Nt) 34 r-Proteine 5‘ 3‘ 30S 16S rRNA (1540 Nt) 21 r-Proteine

6 Die Kristallstruktur der 30S Untereinheit
16S rRNA Die Kristallstruktur der 30S Untereinheit 5‘ 3‘

7 Die Ribosomen-Biogenese läuft im Nukleolus ab
>> eukaryontische Ribosomen entstehen im Zellkern, genauer im Nukleolus, und müssen von dort über das Nukleoplasma ins Zytoplasma gelangen, wo sie die mRNA translatieren Zytoplasma Zellkern Nukleolus rDNA Prä-rRNA (45S) 5S rRNA 28S 5.8S 5S 18S 40S Untereinheit 60S Untereinheit Ribosomale Proteine (L, S) Präribosomale Partikel Die komplizierte Ribosomen-Entstehung im Nukleolus erfordert zeitliche und räumliche Koordination von vielen Teilprozessen. Dies wird durch die hohe strukturelle Organisation des Nukleolus gewährleistet.

8 Ribosomen synthetisieren Polypeptide
mRNA 60S Bereich für Peptidsynthese 40S Ausgang für die Polypeptidkette die mRNA liegt wie ein Kabel auf einer Plattform in einer Einbuchtung der 40S bzw. 60S Untereinheit. Dort ist auch der Bereich der Peptid-Synthese. Die wachsende Polypeptid-Kette tritt durch einen Art Tunnel innerhalb der großen Untereinheit aus dem Ribosom heraus. Nach der Polypeptid-Synthese faltet sich die Aminosäure-Kette in ihre korrekte 3-D-Konformation

9 Die Initiation der Protein-Synthese
mRNA Initiationsfaktor IF-3 bindet an die 30S Untereinheit, was die Anlagerung der 50S Untereinheit zunächst vehindert Anbindung der mRNA: Shine-Delgarno-Sequenz komplementär zum 3‘-Ende der 16S rRNA >> Positionierung des AUG im P-Bereich Shine-Delgarno-Sequenz Prokaryontische mRNA Eukaryontische mRNA 16S rRNA 5‘ 3‘ Ribosomen-Scan 40S Untereinheit 5‘-Kappe m7G fMet fMet Bindung der fMethionyl-tRNA im P (=Peptidyl)-Bereich durch Codon::Anticodon-Wechselwirkung. Die tRNAfMet kann nur im P-Bereich, nicht im A-Bereich binden, was durch IF2 kontrolliert wird. 50S Unter- einheit IF2 ist eine GTPase. Unter GTP-Hydrolyse durch IF2 kann schließlich die 50S Untereinheit andocken, wobei IF2 und IF3 das Ribosom verlassen >> Ende der Initiation

10 Die Elongation bei der Protein-Synthese
fMet C C C Die Elongation bei der Protein-Synthese Pro G G G verschiedene Elongationsfaktoren (EF-Tu, EF-Ts), die GTPasen sind und GTP hydrolysieren, sind an der korrekten Anlagerung von tRNA an das Ribosom beteiligt dabei bildet sich zunächst ein Komplex zwischen der 2. tRNAPro und EF-Tu::GTP. Erst dann kann die Bindung im A-Bereich erfolgen nachdem sich der Initiationskomplex (funktionelles 70S Ribosom) gebildet hat, kann sich die zweite tRNA, die mit der entsprechenden Aminosäure beladen ist, an die A-Position anlagern. Die Auswahl der richtigen tRNA erfolgt auf Grund der richtigen Codon::Anticodon- Wechselwirkung fMet G G G C C C Pro anschließend wird GTP hydrolysiert und EF-Tu::GDP wird aus dem 70S Ribosom freigesetzt. Unter Vermittlung von EF-Ts wird EF-Tu::GTP wieder regeneriert

11 Die Verknüpfung der beiden Aminosäuren im Aminoacyl (A)-Bereich > Bildung der Peptidbindung
Pro G G G fMet C C C dadurch wird im A-Bereich eine Dipeptidyl-tRNA erzeugt, während im P-Bereich eine deacylierte tRNAfMet entsteht. ursprünglich wurde angenommen, daß ein Enzym (Peptidyl-Transferase) die Peptid-Bindung im 70S Ribosom katalysiert jedoch entdeckte man, daß die 23S rRNA diese Katalyse-Wirkung hat (keine Enzym, sondern ein Ribozym!) G G G C C C fMet Pro Bildung der Peptid-Bindung nach die Anlagerung der 2. Aminoacyl-tRNA an der A-Stelle, wird die neue Peptid-Bindung zwischen den bei den Aminosäuren geknüpft. Dabei greift die NH2- Gruppe der Aminosäure 2 die COOH-Gruppe der Amino- Säure 1 an der Initiator-tRNAfMet an.

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13 Die Translokation der Dipeptidyl-tRNA2
das geschieht dadurch, daß das gesamte Ribosom sich exakt um die Länge eines Triplett-Codons in Richtung 3‘-Ende der mRNA bewegt (= Translokation) da die Dipeptidyl-tRNA2 noch immer am 2. Codon befestigt ist, wird sie durch die Bewegung des Ribosoms vom A-Bereich in den P-Bereich verschoben, wodurch die deacylierte tRNAfMet aus dem P-Bereich ins Zytoplasma verdrängt wird G G G C C C fMet Pro Die Translokation der Dipeptidyl-tRNA2 G G G C C C fMet Pro A C A Gly U G U GTP EF-G + GDP + Pi Translokation damit der Elongationszyklus nicht stoppt und weitere Aminosäuren angeknüpft werden, muß die Dipeptidyl-tRNA2 von der A-Position zur P-Position übertragen werden. das 3. Codon (UGU) der mRNA liegt jetzt im A-Bereich, das 2. Codon im P-Bereich. Diese Verschiebung benötigt ein Enzym (EF-G), das als Translokase unter GTP-Verbrauch diesen Schritt katalysiert.

14 Die Termination der Polypeptid-Synthese
NH2 UAG = Stop-Codon Ser A C C U G G der Elongationszyklus schreitet solange fort, bis das Ribosom die letzte Aminosäure angefügt hat und damit das von der mRNA codierte Polypeptid fertiggestellt hat Die Termination der Polypeptid-Synthese die Termination wird durch eines der 3 Stop-Codons (UAG - UAA - UGA) in der mRNA, für welche es keine komplementären Anticodons in der tRNA gibt, signalisiert sobald ein Stopcodon im A-Bereich erscheint, beteiligen sich 3 Terminationsfaktoren (RF = “releasing factors“) an der: 1. Hydrolyse der terminalen Peptidyl-tRNA-Bindung 2. Freisetzung des Polypeptids 3. Dissoziation des 70S Ribosoms Hydrolyse der Polypetidyl-tRNA- Verknüpfung NH2 Ser A C C U G G 50S 30S Dissoziation der Komponenten

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16 Translation im Detail

17 Translation in der Animation

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19 Die Protein-Biosynthese ist sehr energie-aufwendig
> Bildung der Aminoacyl-tRNA = 2 ATP > Elongation = 1 GTP > Translokation = 1 GTP ______________________________________________ 4 ATP = 4 x energiereiche Bindungen pro 1 Peptid-Bindung = 122 kJ/mol-1 1 Peptid-Bindung hat dagegen einen Energie-Gehalt von -21 kJ/mol -1

20 Mehrere Ribosomen synthetisieren gleichzeitig an einer mRNA
Ribosom mit kurzer Polypeptid-Kette fertig-gestellte Polypeptid-Kette Start-Codon Stop-Codon mRNA Polysomen an der mRNA

21 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

22 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

23 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

24 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

25 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

26 Hemmung der Protein-Biosynthese durch viele Puromycin
Peptidyl- Transferase Hemmung der Protein-Biosynthese durch viele Puromycin Die Wirkweise des Puromycins (aus Streptomyces alboniger) bei der Hemmung der Protein-Biosynthese Puromycin ähnelt in seiner Struktur dem 3‘-Ende einer Aminoacyl-tRNA und kann daher im A-Bereich binden Peptidyl- Puromycin Puromycin nimmt anschließend an allen Elongations-Schritten Teil bis einschließlich der Bildung der Peptid-Bindung (Peptidyl-Puromycin) Puromycin kann dagegen nicht im P-Bereich binden und dissoziiert daher als Peptidyl-Puromycin vom Ribosom ab.

27 die Protein-Biosynthese ist ein zentraler Vorgang in der Zelle
und daher ein Hauptangriffs-Ziel natürlich vorkommender Antibiotica und Toxine (Tetracyclin, Chloramphenicol etc.) wegen der Unterschiede bei der Proteinsynthese Bakterien/Eukaryonten hemmen die meisten Antibiotica/Toxine bei den Eukaryonten nicht!

28 Chloramphenicol Tetracyclin Cycloheximid
Antibiotica and Protein-Synthese Bakterien sind für eine Reihe von mit unter letalen Infektionskrankheiten verantwortlich z. B. Tuberkulose,Pneumonia, Meningitis, Wundinfektionen, Syphilis, Gonorrhö. Vor 1940 keine effektive Behandlungsmöglichkeit mit der Entdeckung des Pencillins (hemmt bakterielle Zellwand-Synthese) änderte sich das schlagartig.Viele Antibiotica hemmen die Protein-Biosynthese. Chloramphenicol hemmt Peptidyl-Transferase > Prokaryonten Tetracyclin hemmt Initiation > Prokaryonten Streptomycin Cycloheximid hemmt Peptidyl-Transferase > Eukaryonten

29 Diphtherie-Toxin hemmt die Protein-Biosynthese bei Eukaryonten
durch Blockierung der Translation >> Diphtherie war lange Zeit eine häufige Todesursache bei Kindern. Verursacht durch ein Toxin des Corynebakteriums diphtheriae, das sich im oberen Respirationstrakt einnistet und vermehrt >> bereits wenige mg des Gifts sind für nicht-immunisierte Personen tödlich Die A-Domäne ist ein Enzym und katalysiert die Übertragung eines ADP-Ribosyl-Restes vom NAD+ auf den Elongations- Faktor EF2 A-Domäne B-Domäne Die B-Domäne vermittelt die Aufnahme in die Zelle Hemmung der Translation Zelltod

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31 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

32 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

33 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

34 Regulation der Protein-Synthese
Adäquate Häm-Menge Inadäquate Häm-Menge inaktiv eIF2-Phosphorylierung aktiv Translation läuft kontinuierlich ab Translation ist blockiert Austausch von GDP zu GTP ist blockiert Regulation der Protein-Synthese

35 Ribosomen synthetisieren auch sezernierte Proteine (z. B. Insulin)

36 Der Lebenszyklus einer mRNA

37 Protein-Synthese Export
Zytoplasma Zellkern Gen Transkription mRNA (Boten-RNA) Import Protein Protein-Synthese Ribosom Export

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