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In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R.

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Präsentation zum Thema: "In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R."—  Präsentation transkript:

1 In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R 5´ 3´ D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P 5´ 3´ D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P D-R P 5´ 3´ Das Rückgrat jeder Kette ist der Phosphate (P)-----Desoxyribose (D-R) -Strang Die Basen sind wie Rippen an diesem Rückgrat angeordnet, und jeweils an die Desoxyribosen gebunden Die beiden Stränge sind antiparallel angeordnet 5´ 3´ 3´ 5´ Die beiden Stränge treten entlangen der Basen zusammen und werden zusammengehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen A und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C bilden ein Basenpaar mit 3 H-Brücken

2 Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen

3 Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen

4 Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen nm kJ/mol biologisch releveant

5 Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung die beiden DNA-Stränge treten entlang der Basen zusammen und werden zusammen- gehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen die Basen auf den gegenüberliegenden Strängen stehen sich exakt gegenüber A und T ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C ein Basenpaar mit 3 H-Brücken die Basen sind planar gebaut > Stapelung der Basenpaare in der Doppelhelix (´base stacking´) 5´ 3´5´ 3´ H-Brücken

6 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung G = C A+G = T+C A = T

7 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

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9 Strukturprinzip der Doppelhelix das Desoxyribose-Phosphat- Rückgrat bildet eine Helix-Struktur aus die Basen sind zum Innern der Helix gekehrt und die Desoxyribose/Phosphat- Reste liegen an der Außenseite die Ringebenen der Basen stehen senkrecht zur Helixachse die Zucker stehen fast im rechten Winkel zur Base die genetische Information liegt in der Abfolge der Basenpaare TAGCGT Leiter-Modell Ribbon-Modell

10 Raumfüllendes Kalottenmodell 1. Strang (5´) 2. Strang (3´) große Furche kleine Furche rote Linien verbinden die Phosphat-Reste DNA-bindende Proteine können spezifisch an die DNA binden. Dabei lagern sich die Proteine in die große bzw. kleine Furche ein und bekommen dadurch Zugang zu den Basen. Dadurch ist die Erkennung einer spezifischen Basenabfolge möglich (z. B. Transkriptionsfaktoren, Restriktionsenzyme)

11 Rechtsläufige Doppelhelix Entspricht 99% der zellulären DNA GCGCGCGC Abfolge Zick-Zack Verlauf des Phosphodiester-Bandes Linksläufige Doppelhelix Entsteht bei drastischer Abnahme des Wassergehalts Rechtsläufige Doppelhelix Basenpaare nicht senkrecht wie bei B-Form, sondern um 70° gekippt Offener Raum im Molekülinneren

12 Zusammenfassung der DNA Struktur

13 1953 haben Watson & Crick die drei-dimensionale Struktur der DNA -Doppelhelix aufgeklärt und sofort den Mechanismus der DNA-Replikation vorhergesagt

14 wichtig ist, daß die genetische Information (= Abfolge der Basensequenz in der DNA-Kette) während der Zellteilung exakt von der Mutterzelle auf die Tochterzelle übertragen wird bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze Fehler können sich kastastrophal auf die Lebensfähigkeit der Zelle auswirken, oder Krebs entstehen lassen

15 bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze

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17 Reißverschlußartige Trennung der beiden Elternstränge entlang der Basenpaare = Brechen der H-Brücken Identische Verdopplung

18 Parentale DNA- Doppelhelix DNA-Moleküle nach einer Runde der Replikation Konservative Replikation A1 A2 Semi-Konservative Replikation A1 A2 A1A2N1N2A1A2N2N1 Semi-konservative DNA-Verdopplung wurde durch Watson & Crick (1953) vorhergesagt, aber erst durch ein klassisches Experiment (1959) bewiesen von Meselson & Stahl

19 Der semi-konservative Replikationsmechanismus wurde zunächst für E. coli gezeigt, und später für alle Organismen einschließlich Homo sapiens bewiesen

20 Verfüttern von 15 N-Stickstoff Nährmedium an E. coli DNA enthält normalen = leichten 14 N-Stickstoff E. coli Leichte DNA DNA enthält jetzt ausschließlich schweren 15 N-Stickstoff Schwere DNA Anschließende Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation Rückführung der Bakterien in 14 N-Stickstoff-Nährmedium für eine Verdopplungszeit von 20 min

21 1. Verdopplung mit 14 N-Stickstoff (leicht = L) 2. Verdopplung mit 14 N-Stickstoff (leicht = L) Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation S-S S- L L-L S-SS- L L-L Semi-konservativ konservativ Mögliche ErgebnisseExperimentelle Befunde (Meselson & Stahl, 1958) Wachstum in 15 N-Medium Schwere DNA (schwer = S) S-S S-LS-L L-LS-LS-L

22 Das Beweis-Experiment, daß auch eukaryontische DNA semi-konservativ repliziert wird Dazu wurden Wurzelzellen mit [ 3 H]-Thymidin (radioaktiver Wasserstoff!) durchmarkiert, isoliert und anschließend autoradiographisch untersucht Radioaktiv-markiert Probe (z. B. [ 3 H]-Thymidin-markiertes Chromosom) beim -Zerfall des Tritiums werden Elektronen frei, die den Röntgenfilm an den Stellen schwärzen (Ag-Körner), an denen die Chromosomen auf dem Film aufliegen. Genauigkeit der Lokalisierung: ca m Objektträger Röntgen-Film mit AgBr-Emulsion e-e-

23 …….semi-konservative Replikation von eukaryontischer DNA in Wurzelzellen A1 A2 A1 N1 A2 N2 Teilung DNA-Replikation in nicht-radioaktivem Medium DNA-Synthese in radioaktivem Medium [ 3 H]-Thymidin 2n 1n 2n beide Schwester- Chromatide sind markiert Autoradiographie-Bild nur ein Schwester- Chromatid ist markiert Autoradiographie-Bild

24 Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional Die Replikation der DNA erfolgt nicht spontan, sondern wird durch Enzyme (DNA-Polymerasen) katalysiert Grundsätzlich gilt, daß die DNA-Polymerasen die Replikation nicht an jeder beliebigen Stelle der DNA initiieren, sondern nur am Replikations- Startpunkt = Origin Replikationsgabel

25 am häufigsten findet man, daß die Replikation am Origin beginnt und sich von dort bi-direktional forstsetzt dadurch entstehen 2 Replikationsgabeln bei ringförmiger DNA (z. B. E. coli) genügt meist ein Origin. Die beiden dort entstehenden Replikationsgabeln verschmelzen schließlich auf der gegenüberliegendenen Seite des Origins nach erfolgter Replikation Ende der Replikation Wachstum in beide Richtungen rechte Wachstumsgabellinke Wachstumsgabel

26 die langen, linearen eukaryontischen Chromosomen (= lineare DNA) haben viele DNA-Replikations-Startpunkte (vermutlich einige tausende bis zehntausende Origins beim Menschen) die bi-direktionalen Replikationsgabeln bewegen sich aufeinander zu, solange bis sich benachbarte Startpunkte begegnen durch das Vorhandensein von vielen Replikons (Replikations- Startstellen) schafft es die eukaryontische Zelle die ca fach größere DNA (vgl. E. coli > Mensch) in der erforderlichen Zeit zu replizieren

27 Der Nachweis der bi-direktionalen DNA-Replikation wurde durch Autoradiographie von radioaktiv markierter DNA, die aus Säugerzellen isoliert wurde, erbracht. Markierung der DNA erfolgte mit [ 3 H]-Thymidin, zunächst von niedriger Radioaktivität.Nach Beginn der Replikation wurde die Menge an radioaktivem [ 3 H]-Thymidin erhöht. Anschließend wurden die Chromsomen autoradiographiert. Autoradiogramm e-e- hohe niedrige hohe Radioaktivität hohe niedrige hohe Radioaktivität Ori 1Ori 2 [ 3 H]-markierte DNA

28 Elektronenmikroskopische Aufnahmen von sich replizierender DNA aus Drosophila-Zellen, die sich rasch teilen (= aktive DNA-Replikation). Die Pfeile zeigen Replikationsblasen, in denen bi-direktionale Replikation stattfindet. 1n DNA Replikationsblase 2n DNA Replikationsgabel Sichtbarmachen von Replikationsblasen

29 Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln hohe niedrige hohe Radioaktivität Länge der radioaktiv markierten DNA ( m ) in Abhängigkeit der Replikationsdauer t2t2 t3t3 OriC t1t1 Zellen werden unterschiedlich lang mit [ 3 H]-Thymidin markiert, bevor die DNA isoliert und autoradiographisch analysiert wird durch die Länge der Schwärzung auf dem Röntgenfilm kann die Geschwindigkeit, mit der sich die Replikationsgabel entlang der DNA bewegt, bestimmt werden

30 Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln Länge der DNA auf dem Autoradiogramm proportional zur Anzahl der replizierten Basenpaare > Bestimmung der Replikationsgeschwindigkeit = 1000 BP/sec/Gabel bei E.coli Kleine Rechnung bei E. coli dauert die Replikation 20 min (Genomgröße = 3 x 10 6 BP) bei 2 Replikationsgabeln mit einer V = 1000 BP/sec stimmen theoretischer und errechneter Wert überein 1200 sec x 1000 BP = 1.2 x 10 6 BP bei 2 Gabeln: 2.4 x 10 6 BP Homo sapiens ~ 100 BP/sec/Gabel (Autoradiographie) bei 3 x 10 9 BP/Genom benötigt man ca Replikationsgabeln für die Replikation des gesamten Genoms (in ca.10 hr)

31 Wie funktioniert der einzige Origin of Replication in E. coli? DnaA (ATPase) Erkennung Startkomplex Offener Komplex 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Prä-Priming Komplex - Primase - DNA-Polymerase Replikation leichtes Schmelzen der DNA OriC


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