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Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = Origin Replikationsgabel.

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Präsentation zum Thema: "Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = Origin Replikationsgabel."—  Präsentation transkript:

1 Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional DNA-Polymerasen starten die Replikation am Replikations-Startpunkt = Origin Replikationsgabel

2 Wie funktioniert der einzige Origin of Replication in E. coli? DnaA (ATPase) Erkennung Startkomplex Offener Komplex 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Prä-Priming Komplex - Primase - DNA-Polymerase Replikation leichtes Schmelzen der DNA OriC

3 Brechen der H-Brücken ( Helicase) entlang der Basenpaare ori

4 Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut? o 5 > 3 Verknüpfung (Phospho-Diester-Brücken) o 5-Ende mit Phosphat-Gruppe o 3-Ende mit freier OH-Gruppe 5 3 Nukleophiler Angriff der 3-OH Gruppe am -Phosphoatom allgemein gilt: Desoxynukleosid-5-Triphosphate sind die aktivierten Vorstufen bei der DNA-Synthese: dATP, dCTP, dGTP, dTTP (dNMP) n + dNTP (dNTP) n+1 + PP i DNA-Polymerase Neu-eintretendes Desoxy-Nukleosid-Triphosphat O + 0

5 Die Biochemie der DNA-Kettenverlängerung Wie werden die Desoxy-Nukleotid-Bausteine in die DNA eingebaut?

6 (dNMP) n + dNTP (dNMP) n+1 + PP i DNA-Polymerase grundsätzlich gilt, daß DNA-Polymerasen nur synthetisieren können 5>3 d. h. DNA-Polymerasen besitzen eine 5>3 Polymerase-Aktivität Bewegung der Replikationsgabel 5 3 DNA-Polymerase Die Biochemie der DNA-Replikation

7 Das Problem der lagging strand DNA-Replikation DNA-Polymerasen besitzen eine 5>3 Polymerase-Aktivität 5 3 Bewegung der Replikationsgabel DNA-Polymerase kontinuierlicher Strang (leading strand) dis-kontinuierlicher Strang (lagging strand)

8 Noch ein anderes Problem bei der DNA-Replikation......

9 DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen RNA-Primer zum Start der Replikation Primer DNA-Polymerase DNA-Polymerasen verwenden den einzelsträngigne DNA-Strang als Matritze, aber der Einzelstrang muß einen Primer gebunden haben (doppelsträngiger Abschnitt), damit die DNA-Polymerase den 2. Strang auffüllen kann

10 DNA-Polymerasen benötigen einen kurzen RNA-Primer zum Start der Replikation leading strand lagging strand DNA-Polymerase Primer

11 Okazaki Fragment Die vollständige Synthese des Folgestrangs

12 Die Ligase-Reaktion DNA-Ligase + ATP + PP i

13 Die einzelnen Schritte der Ligase-Reaktion ATP PP i Enzym-AMP AMP -Aminogruppe eines Lysins

14 Vergleich der drei DNA-Polymerasen von E. coli Anzahl der Untereinheiten Synthese-Rate (Nukleotide/sec) Prozessivität (eingefügte Nukleotide vor dem Abdissoziieren) 3>5 Exonuclease (Korrekturlesen) 5>3 Exonuclease Molekulargewicht ja nein 103 kDa88 kDa900 kDa DNA-Reparatur DNA-Replikation

15 Untereinheiten und Struktur der DNA-Polymerase III von E. coli Die DNA-Polymerase III (Holoenzym) bildet einen Dimer und kann dadurch gleichzeitig sowohl am Leitstrang wie am Folgestrang synthetisieren. Die Synthesegeschwindigkeit beträgt: V = 1000 BP/sec DNA-Polymerase III -Untereinheit mit DNA-Polymerase- Aktivität (5>3) -Untereinheit für die Bindung an die DNA -Untereinheit 3>5 Exonuclease vermutlich Schleifenbildung

16 Akzessorische Proteine der DNA-Polymerase Klammer Griff Der Griff-Klammer-Komplex (RFC-PCNA) kann armreifartig an der DNA entlanggleiten. An den Griff-Klammer-Komplex bindet die DNA-Polymerase III, die während der Replikation dadurch mit hoher Prozessivität an der DNA entlangwandern kann, ohne dabei abzufallen DNA-Polymerase III DNA Kristallstruktur von Klammer-Dimer Komplex

17 Das E. coli Replisom mit seinen verschiedenen Komponenten Bewegungsrichtung der Replikationsgabel LeitstrangFolgestrang SSB RNA-Primer Helicase DNA-Polymerase I + Ligase Okazaki- Stücke Pol III (DNA-Polymerase) Primase Primosom Damit die DNA- Replikation in der Replikationsgabel kontinuierlich voran- schreiten kann, muß die doppelsträngigeDNA in der Gabel in die Einzelstränge getrennt werden. >> Eine DNA-Helicase windet unter ATP- Verbrauch die DNA auf. Damit die entwundene DNA kurzzeitig einzelsträngig bleibt, bindet das SSB (single-stranded DNA-binding protein) an die noch nicht replizierte DNA. Damit wird die Verknäuelung der ss-DNA verhindert. Später wird das SSB von der vorrückenden DNA-Polymerase wieder von der Matritze abgetrennt.

18 Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang jedoch: ein- und dieselbe DNA-Polymerase III synthetisiert gleichzeitig Leit- und Folgestrang!

19 Primosom Helicase DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer Schleifenbildung Leitstrang Folgestrang Primer Okazaki- Stück Bewegungsrichtung der Replikationsgabel DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Schleifenbildung am Folgestrang bei der DNA-Replikation

20 Primosom Helicase DNA-Polymerase III Holoenzym-Dimer Primer Schleifenbildung Schleifenbildung bei der Synthese von Leit- und Folgestrang 3 5 DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer Okazaki- Stück

21 DNA-Polymerase III Holonenzym-Dimer Die Schleifenbildung an der DNA-Folgestrangmatritze ermöglicht der dimeren DNA-Polymerase III die Synthese beider Tochterstränge in der Replikationsgabel. Dadurch wird die physikalische Richtung am Folgestrang, nicht aber die biochemische Richtung (5´>3´) umgedreht

22 Topoisomerase Bewegungsrichtung der Replikationsgabel Leitstrang Folgestrang DNA-Polymerase III Griff RNA-Primer SSB RNA-Primer Primase Okazaki- Stücke Helicase Ligase Klammer DNA-Polymerase I Eine konzertierte Aktion bei der Synthese von Leit- und Folgestrang

23 Die gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch die dimere DNA-Polymerase III

24 Eine Computer-Animation: gleichzeitige Synthese von DNA Leit- und Folgestrang durch das Holo-Enzym DNA-Polymerase III

25 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung 53 Essentielle Grundlage des Lebens ist die Fähigkeit der identischen Reduplikation des genetischen Materials und damit letztendlich der Vererbung einer funktionsfähigen Zellstruktur. Welche Aussage zur Replikation der DNA trifft zu? (A)Beim Start der Replikation werden RNA-Primer synthetisiert. (B)Die Neusynthese der DNA erfolgt an beiden Strängen einer Replikationsgabel in kürzeren Stücken, so genannten Okazaki-Fragmenten. (C)Für die Verknüpfung der DNA-Fragmente nach Entfernen der Primer phosphoryliert die DNA-Ligase das 3-OH-Ende eines Fragmentes. (D)Helicasen schützen intermedär gebildete einzelsträngige DNA-Bereiche vor Schädigungen und Strangbrüchen. (E)Interkalatoren, die als Zytostatika in der Tumortherapie eingesetzt werden, binden spezifisch die DNA-Polymerasen.

26 Die Entwindung des DNA-Matritzenstrangs während der DNA-Replikation führt zu Verdrillungen

27 dadurch Verdrillung der DNA Entwinden der DNA während der Replikation durch die Helicase Transienter Bruch des einen Strangs erlaubt freie Rotation der DNA-Stränge und Entdrillung der beiden Stränge >>katalysiert durch DNA-Topoisomerase Replikation

28 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

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30 Nukleosomen-Assemblierung nach DNA-Replikation in Eukaryonten

31 Die Enden der menschlichen Chromosomen sind linear >>> Probleme bei der Replikation Telomerase mit RNA Primer

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