Pflanzliche Symbiosen Gesamttitel Pflanzliche Symbiosen Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken Herbstsemester 2009 Freitag, 14-18, alternierend mit "Geobotanik" (Christian Körner) http://plantbiology.unibas.ch/teaching/teaching.htm

3. Bakterien als Pathogene Titelblatt 3. Bakterien als Pathogene

Mutualistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Knöllchen-Symbiose Mutualistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Knöllchen-Symbiose der Leguminosen (Fabaceae) Bilder aus dem WWW

Agrobacterium (Schopfer) Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle) Bilder aus Schopfer und Brennicke, 1999

Vielfalt der Bakterienkrankheiten Skript – p. 2

Pseudomonas phaseolicola Pseudomonas phaseolicola auf Bohnen Bild aus dem WWW

Clavibacter michiganense Clavibacter michiganense auf Tomaten Bild aus dem WWW

Xanthomonas campestris Xanthomonas campestris auf Kohl Bild aus dem WWW

Xanthomonas vesicatoria Xanthomonas vesicatoria auf Tomate Bild aus dem WWW

Feuerbrand: eine gefährliche bakterielle Krankheit für Obstbäume Titel Feuerbrand Feuerbrand: eine gefährliche bakterielle Krankheit für Obstbäume

Erwinia amylovora, ein Bakterium (von Bienen übertragen) Feuerbrand 1 Feuerbrand: Erreger Erwinia amylovora, ein Bakterium (von Bienen übertragen) Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

Vermehrungszyklus des Feuerbrandes Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

Feuerbrand: Symptome beim Apfel Bilder aus dem WWW

Feuerbrand: Quarantäne-Massnahmen Feuerbrand Karte Feuerbrand: Quarantäne-Massnahmen Skript – p. 3

Feuerbrand: Befallskarte im Kanton Zürich im Jahr 2002 Feuerbrand Kt Zürich Feuerbrand: Befallskarte im Kanton Zürich im Jahr 2002 Skript p. 3; Bild aus dem WWW

Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand Cotoneaster Friedhof Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand Bild aus der Berner Zeitung

Cotoneaster befallene Pflanze Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand Bild aus dem WWW

Massnahmen gegen Feuerbrand Feuerbrand-Bekämpfung: Entfernung von Cotoneaster "Beliebte Pflanze macht Ärger" Cotoneaster z.B. in Friedhöfen, Gärten, Anlagen Seit 1. Januar 2003 ist das In-Verkehr-Bringen und Vermehren sämtlicher Cotoneaster Arten in der ganzen Schweiz verboten! Bild aus dem WWW

Agrobacterium tumefaciens und "Genetic engineering" in der Natur Titel Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens und "Genetic engineering" in der Natur

Agrobacterium (Schopfer) Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle) Skript p. 4

Agrobacterium Transformation Agrobacterium und "genetic engineering" in der Natur T-DNA: in Bakterium nicht "exprimiert" Induktion des DNA-Transfers T-DNA - Transfer T-DNA: in Pflanze "exprimiert" Wundsignal Skript p. 4

Agrobacterium: Ti-Plasmid Agrobacterium: das Ti-Plasmid Octopin-Synthese und-Transport Tumor-Gene 1,2: Auxin-Synthese Tumor-Gen 3: Cytokinin-Synthese Skript p. 5

Agrobacterium Octopin Skript p. 5

Erwinia chrysanthemi - Titel Erwinia carotovora und Erwinia chrysanthemi: Pectolytische Enzyme als Angriffswaffen (Pathogenizitätsfaktoren bzw. Virulenzfaktoren)

Erwinia_carotovora_Karotte Erwinia carotovora auf Karotte

Erwinia_carotovora_Salat Erwinia carotovora auf Salat

Erwinia_carotovora_Chicorino Erwinia carotovora auf Chicorino

Erwinia_carotovora_Kartoffel Erwinia carotovora auf Kartoffel

Erwinia_carotovora_Kartoffel Erwinia carotovora auf Radieschen

Angriffswaffen von Bakterien

Erwinia_carotovora_Radies Angriff eines Weichfäule-Bakteriums (Erwinia sp.) Bakterien "mazerieren" das Gewebe! (Auflösung der Mittellamelle aus Pectin) Skript p. 6

Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme Polygalacturonsäure (Pectin) + H2O Hydrolase: Pectinase Lyase: Pectolyase Skript p. 6

Pathogenitätsfaktor/ Virulenzfaktor Klassische Fragestellung der (molekularen) Phytopathologie "Ist ein gegebenes Molekül (Enzym, Toxin etc.) kausal für die Krankheit wichtig?" Ist es ein Pathogenitätsfaktor? Pathogenitätsfaktoren sind qualitativ wichtig: Krankheit ja oder nein ... Ist es ein Virulenzfaktor? Virulenzfaktoren sind quantitativ wichtig: stärkere oder geringere Symptome Ist es ein (unwichtiges) Begleitprodukt? Skript p. 7

Klassische Fragestellung der Pathologie Kochsche Postulate Klassische Fragestellung der Pathologie "Ist ein gegebener Mikroorganismus kausal für die Krankheit wichtig?" Der Mikroorganismus muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein. Der Mikroorganismus muss in Reinkultur isoliert werden können. Der isolierte Mikroorganismus muss die Krankheits- symptome auslösen Koch'sche Postulate Skript p. 7

Robert Koch, der Entdecker des Tuberkulose-Erregers 1843 Robert Koch wird in Clausthal (Harz) geboren. Er wächst gemeinsam mit zehn Geschwistern auf. 1866 Abschluß seines vierjährigen Medizinstudiums in Göttingen 1867- 1880 Tätigkeit als praktischer Arzt 1876 Bei Versuchen zur Entstehungsgeschichte der gefürchteten Tierseuche Milzbrand weist Koch erstmals spezifische Krankheitserreger als Krankheitsursache nach. Bisher führte man diese Krankheit auf "Miasmen", d.h. die Luft verunreinigende Gifte, zurück. Publikation der Versuchsergebnisse in "Beiträge zur Biologie der Pflanzen". 1881 Koch gelingt der Nachweis des Tuberkulose-Bakteriums 1884 Er entwickelt mit den "Kochschen Postulaten" eine Definition bakteriologischer Erregernachweise, die in abgewandelter Form bis heute Gültigkeit hat. 1885 Berufung zum Professor an der Berliner Universität 1897-1906 Wiederholte Forschungsreisen in die Tropen. Er untersucht Entstehung und Ausbreitung der Pest, der Malaria, der Schlafkrankheit und der Rinderpest. 1905 Nobelpreis für Medizin. 1910 Koch stirbt in Baden-Baden Bild aus dem WWW

Robert Koch, Expedition Robert Koch auf einer seiner Expeditionen Bild aus dem WWW

Die Koch'schen Postulate (publiziert 1884) Kochsche Postulate Die Koch'schen Postulate (publiziert 1884) ... so müssen sich jene drei Postulate erfüllen lassen, deren Erfüllung für den stricten Beweis der parasitären Natur einer jeden derartigen Krankheit unumgänglich nothwendig ist: 1.) Es müssen constant in den lokal erkrankten Partien Organismen in typischer Anordnung nachgewiesen werden. 2.) Die Organismen, welchen nach ihrem Verhalten zu den erkrankten Theilen eine Bedeutung für das Zustandekommen dieser Veränderung beizulegen wäre, müssen isolirt und rein gezüchtet werden. 3.) Mit den Reinculturen muss die Krankheit experimentell wieder erzeugt werden können. Skript p. 7

Molekulare Version Kochsche Postulate Entsprechendes Vorgehen für molekulare Studien "Ist ein gegebenes Molekül kausal für die Krankheit wichtig?" Das Molekül muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein. Das Molekül muss isoliert und gereinigt werden können. Das isolierte Molekül muss die Krankheitssymptome auslösen. Mutanten des Krankheitserregers, die das Molekül nicht bilden, müssen avirulent sein. Skript p. 7

Beispiel: pectolytische Enzyme Beispiel: Pectolytische Enzyme von Erwinia chrysanthemi "Sind die pectolytischen Enzyme kausal für die Krankheit wichtig?" Enthält das kranke Gewebe pectolytische Enzyme? Ja! Können pectolytische Enzyme isoliert werden? Ja! Lösen isolierte pectolytische Enzyme die Krankheits- symptome aus? Ja! Aber: Erwinia chrysanthemi besitzt mehrere verschiedene pecto-lytische Enzyme! Welche davon sind Virulenz-/bzw. Pathogenitäts-faktoren? Skript p. 7

Alan Collmer (Cornell University, Ithaca, New York)

Jagd auf pectolytische Enzyme Bakterium wird auf Medien mit Pectin gezüchtet (Pectin als C-Quelle). Pectolytische Enzyme werden isoliert, gereinigt, charak- terisiert, ansequenziert. Gene für die entsprechenden Proteine werden identi- fiziert, kloniert. Sechs verschiedene pectolytische Enzyme identifiziert und deren Gene kloniert: pehX, pelX, pelA, pelB, pelC und pel E! Skript p. 7

Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte Funktionstest Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte Klonierte Gene werden in Escherichia coli exprimiert (Laborstamm, der kein Pectin spalten kann). Transgene Escherichia coli werden auf Pectin-Platten ausplattiert. Kolonien, welche pectolytische Enzyme produzieren, machen "Löcher" in die Platte. Alle sechs Gene liefern funktionelle Enzyme! Skript p. 7

Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte Pectinagar-Test Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte JOURNAL OF BACTERIOLOGY 179 (8): 2503-2511 APR 1997

Wie geht es jetzt weiter? Knock-out Mutanten Knock-out der entsprechenden Gene in E. chrysanthemi Homologe Rekombination ("Marker-Austausch") mit Hilfe eines DNA-Stücks, das aussen Homologie zum Ziel-Gen aufweist und im Zentrum einen "Resistenz-Marker". Mutierte Stämme werden mit Hilfe des "Resistenz- Markers" selektioniert; Mutationen werden kombiniert Der sechsfach mutierte Stamm sollte keine "Löcher" mehr in Pectin-Platten machen. Stimmt! Grosse Überraschung: Der sechsfach mutierte Stamm ist auf Chrysanthemen-Blattstücken immer noch pathogen!! Wie geht es jetzt weiter? Skript p. 8

Abstract Kelemu/Collmer 93 Suche nach weiteren pectolytischen Enzymen! Skript p. 8

Wie geht es jetzt weiter? Schlussfolgerung Schlussfolgerung Die neu entdeckten Enzyme kommen im kranken Gewebe vor! Die neu entdeckten Enzyme können isoliert werden! Die isolierten Enzyme verursachen die Krankheits- symptome (Mazerierung des Gewebes)! Die Koch'schen Postulate sind erfüllt! Wie geht es jetzt weiter? Skript p. 8

Angriffswaffen von Bakterien Abwehrkräfte der Pflanzen

Review Innate Immunity "Erkennung": Flagellin-Erkennung und "innate immunity" Skript p. 9

Review Innate Immunity "Innate immunity" bei Tieren und Pflanzen Skript p. 9

Review Innate Immunity Ablauf der Immun-Abwehr bei PFlanzen Skript p. 9

Titel Zipfel Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 10

Zipfel Fig. 1a Fig. 1a: Bakterien-Wachstum in Pflanzen, die mit flg22 vorbehandelt wurden Dieses Experiment zeigt auch, dass es bei Infiltration keinen Unterschied in der Anfälligkeit von Wildtyp und fls2 gibt ... Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 11

Fig. 3a: Krankheits-Anfälligkeit bei Sprüh-Inokulation Zipfel Fig. 3a Fig. 3a: Krankheits-Anfälligkeit bei Sprüh-Inokulation ... aber bei Sprüh-Inokulation sind die fls2 Mutanten deutlich empfindlicher! Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 11

Fig. 3b: Bakterielles Wachstum nach Sprüh-Inokulation Zipfel Fig. 3b Fig. 3b: Bakterielles Wachstum nach Sprüh-Inokulation Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 11

Zipfel Fig. 3c Fig. 3c: Ökotyp Ws-0 (eine natürliche fls2 Mutante) wird durch Transformation mit dem FLS2-Gen resistenter! Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 11

Die flg22-induzierte Resistenz ist auch in Mutanten aktiv! Skript p. 11

Fig. 2: Es muss noch weitere MAMPs geben! Zipfel Fig. 2 Fig. 2: Es muss noch weitere MAMPs geben! Zipfel et al., Nature 428, 764-767, 2004 Skript p. 11

Angriffswaffen von Bakterien Hrp-Gene und das "Wettrüsten" zwischen Bakterien und Pflanzen

Entdeckung von hrp-Genen Interessante Beobachtung: Bestimmte Mutationen bei phytopathogenen Bakterien (Beispiel: Pseudomonas syringae) führen: 1) zum Verlust der Fähigkeit, in der inkompatiblen Inter-aktion eine "Hypersensitive Reaktion" (HR) auszulösen, und gleichzeitig 2) zum Verlust der Pathogenität in der kompatiblen Interaktion. Die entsprechenden Gene wurden hrp genannt. Skript p. 12

Hrp-Gen-Cluster Der "Hrp gene cluster" Mehrere Transkripte und viele Proteine für den gleichen "Injektionsapparat"! Transkripte/Proteine im Genom anders gruppiert, dienen dem gleichen Zweck ("Injektionsapparat") Skript p. 12

Bakterielle Sekretionssysteme T-DNA! "Effektor-Proteine" "Injektions-Kanüle" z.B. pectolytische Enzyme z.B. Proteasen Skript p. 12

Vergleich Pflanzen/Tiere I Vergleich von Pflanzen und Tieren (I) Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr! Effektor-Proteine fördern Endocytose! Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr! Skript p. 13

Vergleich Pflanzen/Tiere II Vergleich von Pflanzen und Tieren (II) Skript p. 13

Induktion und Funktion Effektor-Proteine Induktion und Funktion der "Effektor-Proteine" "Normaler" Wirt: Effektor-Proteine schwächen Abwehr: Resultat Krankheit Induktion von hrp- und Effektor-Genen R Wirt mit Resistenzgen: Effektor-Proteine werden "erkannt": Resultat HR, keine Krankheit >30 "xop"-Gene für "Effektor-Proteine"! Skript p. 14

Zusammenfassung zur Funktion der "Effektorproteine" Schlussfolgerung Zusammenfassung zur Funktion der "Effektorproteine" Die Effektorproteine sind Virulenzfaktoren, welche u.a. die allgemeine Abwehrbereitschaft der Pflanze reduzieren. Wenn die Pflanze aber ein Resistenzgen gegen ein gegebenes Effektorprotein besitzt, wird dieses ein Avirulenzfaktor und löst eine HR aus. Doppelnatur der Effektorproteine: HR - P ... Nicht im Skript!

"Effektorproteine", AVR-Faktoren und Co-Evolution Schlussfolgerung "Effektorproteine", AVR-Faktoren und Co-Evolution Schritt 5: Pflanze "erkennt" Effektor B Schritt 3: Pflanze "erkennt" Effektor A Stärke der Abwehr Schritt 1: Pflanze "erkennt" Bakterium (z.B. via Flagellin) Schritt 4: Bakterium unterdrückt Erkennung via Effektor B Schritt 2: Bakterium unterdrückt Erkennung via Effektor A Evolution Skript p. 14