Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009 Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser

Qualitätsmanagement des Diabetes INSTAND e. V. HbA1c Bedeutender Parameter im eine glykierte Form des Hämoglobins spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6 Wochen wider Therapieüberwachung Indikator für Therapieerfolg von Patient und Diabetesklinik Qualitätsmanagement des Diabetes Medizinische Analytik SS 2009

INSTAND e. V. Hämoglobin Medizinische Analytik SS 2009

INSTAND e. V. Amadori - Umlagerung Medizinische Analytik SS 2009

ß-Kette des Hämoglobins INSTAND e. V. ß-Kette des Hämoglobins HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – Medizinische Analytik SS 2009

Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine INSTAND e. V. Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine Verfahren Prinzip erfasste Fraktionen Markenname Säulenchromatographie Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b (Makrosäule) chromatographie HbA1c Mikrosäule Ionenaustausch- HbA1 chromatographie HPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, Variant II, Diamat chromatographie HbA1c HA8160, L-9100 FPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, chromatographie HbA1c, Aldimin-Form Affinitätschromatogrphie Phenylboratsäule Gesamt-Glyko GHb, IMx II hämoglobin Immunologische z.B. Immun- HbA1c TinaQuant Verfahren turbidimetrie HA1c Dimension Referenzmethode HPLC-ESI-MS HbA1c bzw. HPLC-CE Medizinische Analytik SS 2009

HbA1c Routine-Methoden INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Testprinzip: Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäule Elution der HbA1c-Fraktion Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels Photometer bei 415 nm Medizinische Analytik SS 2009

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Diagnostische Bedeutung: HbA1c spiegelt die mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8 Wochen wider und ist hiermit wertvoll für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes Mellitus. Die HbA1c-Konzentration kann nach folgender Formel in die mittlere Blutglucose Konzentration (MBG) umgerechnet werden: MBG (mg/dL) = 31,7 x %HbA1c – 66,1 MBG (mmol/L) = 1,76 x %HbA1c – 3,67 Medizinische Analytik SS 2009

In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Referenzbereiche: NGSP IFCC Microsäule (Biocon) Stoffwechselgesunde 4.0 – 6.0 % 2.0 – 4.2 % 4.4 – 6.7 % Diab. Zieleinstellung 6.0 – 6.5 % 4.2 – 4.8 % 6.7 – 7.3 % Überwachungsbereich 6.5 – 8.0 % 4.8 – 6.4 % 7.3 – 9.1 % Therapiebedarf > 8 % > 6.4 % > 9.1 % Für diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse stets im Zusammenhang mit der Anamnese, der klinischen Untersuchung und anderen Untersuchungsergebnissen zu werten. Medizinische Analytik SS 2009

Einführung in die HPLC-MS Analytik

HPLC: High Pressure Liquid Chromatography HPLC-MS Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass in den letzten Jahren in der Medizinischen Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Im Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es mit höchster Präzision und Richtigkeit die Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen z.B aus Blut oder Urin. Durch seine gute Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem Probenaufkommen ( „high throughput“) für die Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring) und z.B. für das Neugeborenen-Screening in Routinelabors eingesetzt. HPLC: High Pressure Liquid Chromatography = chromatographisches Trennverfahren MS: Mass Spectrometry = analytisches Detektionsverfahren Medizinische Analytik SS 2009

“Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.) Chromatographie “Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.) auf Filterpapier : Papierchromatographie auf Kieselgel- beschichteten Glas: Dünnschichtchromatographie über mit Kieselgel-gefüllte Säulen: Säulenchromatographie Medizinische Analytik SS 2009

Chromatographie Ein einfacher Versuch zur Darstellung des Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung: 1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und danach in Alkohol aufgelöst – grüne Lösung 2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück gegeben Blattfarbstoffe in Lösung – 3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die Säule getrennt : gelbe, gelbgrüne, grüne, blaugrüne Medizinische Analytik SS 2009

z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor Chromatographie Detektion: z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor Signal = „Peak“ Medizinische Analytik SS 2009

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie HPLC = High Pressure Liquid Chromatography Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Lösungsmittelflaschen Entgaser Pumpen Probeninjektor Detektor Säule / Säulenofen Abfall Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 1: Lösungsmittel wird von den Pumpen angesaugt (blaue und orange Linien) und zum Mischer gepumpt. Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 2: Gemisch wird zum Probengeber gepumpt (Ventil) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 3: Probenschleife wird mit Lösungsmittelgemisch gefüllt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 4 a: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 4b: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 5: Probe wird zur Säule transportiert Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Schritt 6: Probenbestandteile verlassen die Säule nacheinander und werden im Detektor angezeigt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

Massenspektrometrie Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglicht, Komponenten in komplexen Mischungen zu identifizienen und quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Analyte ionisiert in die Gasphase überführt und nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert detektiert. Medizinische Analytik SS 2009

Aufbau eines Massenspektrometers Ionenquelle Massenanalysator GC/MS: EI, CI Quadrupole LC/MS: ESI, APCI, APPI Ion trap Biomolecules: MALDI Time of Flight Triple Quadrupole Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Ion production Ion transport Ion filtering Fragmentation Ion filtering Ion detection Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Schritt 1: Ionen-Erzeugung im ESI-Interface Ion production Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Electrospray Ionization (ESI) Verbindet HPLC mit MS: Überführung des Analyten flüssig → gasförmig Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Schritt 2: Ionen-Transport vom ESI-Interface ins MS Ion transport Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben + + + - Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

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Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben + + - - + Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Verschiedene Scan-Verfahren (Modi) Quadrupole full scan Selected Ion Monitoring (SIM) Scan ions Filter ions Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Beispiel-Chromatogramme Quadrupole full scan Selected Ion Monitoring (SIM) Identifizierung von unbekannten Komponenten (Information über Molekular-Gewicht) Quantifizierung einer bekannten Komponente über das Molekül-Ion und Frakmentierung Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Schritt 4: Frakmentierung des Analyten (precursor ion) zu substanzspezifischen Bruchstücken (product ions) Fragmentation Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Schritt 5: Ionen-Filter nach Frakmentierung Ion filtering Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Triple Quadrupole System Schritt 6: Detektion der heraus gefilterten Ionen Ion detection Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

Qualitätsmanagement des Diabetes INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes DCCT-Studie DCCT-Studie Diabetes Control and Complication Trial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein National Glycohemoglobin Standardization Program Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

NGSP Kalibration nach Goldstein et al. HPLC Methode mit Kationenaustauscher- Säule (BioRex 70) keine Trennung von HbA1c, HbF und carbamylierten Hämoglobinen Interferenz von HbA0 mit glykierten Hämoglobinen Interferenzen mit abnormen Hämoglobinen → 2.1 % Bias (abs.) Medizinische Analytik SS 2009

Qualitätsmanagement des Diabetes INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit DCCT-Studie Diabetes Control and Complication Trial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein National Glycohemoglobin Standardization Program DCCT-Studie Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

INSTAND e. V. Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC 2. Proteolyse des Hämolysats 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse

Proteolyse des Hämolysats INSTAND e. V. Proteolyse des Hämolysats HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – Glu-C Glu – Lys – Glu – Lys –

1. Hämolyse der Vollblut-Probe INSTAND e. V. Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse 3. HPLC-ESI-MS-Analyse

HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC (Shimadzu) MS (Applied Biosystems) Pumpe A INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC (Shimadzu) Pumpe A Pumpe B Mischkammer Autosampler Säulenoven Degasser Schaltventil Controller MS (Applied Biosystems) API 4000 Triplequadrupol Massenspektrometer ESI-Quelle: TurboVTM source mit TurboIon SprayTM probe Software: AnalystTM Medizinische Analytik SS 2009

HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC-Bedingungen: MS-Bedingungen: INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC-Bedingungen: Zorbax SB-CN, 5 µ 2.1 mm x 150 mm 50 °C, 2 µl Eluent A: 0.025 % TFA in Wasser Eluent B: 0.023 % TFA in Acetonitril Gradient: 300 µl/min Zeit [min] 0 3 9 13.5 13.6 17 17.1 23 % B 0 0 5 5 100 100 0 stop MS-Bedingungen: Scan type: Q1 Multiple Ions Masse: 348.3 amu (nicht-glykiertes Hexapeptid) 429.3 amu (glykiertes Hexapeptid) Dwell time: 1 s Temperatur: 500 °C Medizinische Analytik SS 2009

HPLC-ESI-MS-Analyse LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe ß-N-terminales Hexapeptid von HbA1c m/z 429 amu ß-N-terminales Hexapeptid von HbA0 m/z 348 amu

Rückführbarkeit auf primären Standard - SI Einheiten Referenzmethoden Rückführbarkeit auf primären Standard - SI Einheiten - definierte Reinheit - definierte Messunsicherheit Vergleichbarkeit auf internationaler Ebene - Netzwerk (JCTLM, IFCC HbA1c) Medizinische Analytik SS 2009

HPLC-ESI-MS-Analyse HbA1c Kalibrationskurve nach IFCC INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

INSTAND e. V. Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation HbA1c-Referenzlabor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HbA1c [%] 14 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 raw mean raw mean +/- 4 % Medizinische Analytik SS 2009

Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation HbA1c-Referenzlabor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HbA1c [%] 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 mean P1-P5 overall mean overall mean +/- 2.5 % Medizinische Analytik SS 2009

Bewertungs- grenzen [µg/L] INSTAND e. V. Ringversuch 2005 HbA1c INSTAND e. V. HbA1c sample B [%] sample A [%] Referenzmethode Routinemethoden Probe Zielwert [µg/L] VK [%] Bewertungs- grenzen [µg/L] Mittelwert [µg/L] Bestehensquote [%] A 5.52 2.07 4.41 - 6.63 5.59 8.2 97.2 B 10.5 2.19 8.39 -12.70 6.5 98.8

HbA1c Messergebnisse nach IFCC Referenzmethode und NGSP-Goldstein INSTAND e. V. HbA1c Messergebnisse nach IFCC Referenzmethode und NGSP-Goldstein IFCC (%HbA1c) NGSP (%HbA1c) 2 4 6 8 10 12 12 10 8 6 4 2 NGSP = (0.915 * IFCC) + 2.15 Medizinische Analytik SS 2009

Darstellung von HbA1c - Werten INSTAND e. V. Darstellung von HbA1c - Werten HbA1c Einheit NGSP abgeleitet: % IFCC abgeleitet: ab 2009 mmol/mol bis 2008 % Medizinische Analytik SS 2009

NGSP Werte [%] in IFCC Werte [mmol/mol] INSTAND e. V. “Master Equation” Umrechnung NGSP Werte [%] in IFCC Werte [mmol/mol] IFCC [mmol/mol] = (NGSP [%] - 2.15) / 0.0915 Medizinische Analytik SS 2009

Darstellung von HbA1c - Werten INSTAND e. V. Darstellung von HbA1c - Werten HbA1c NGSP [%] HbA1c IFCC [mmol/mol] new 4.0 20 5.0 31 6.0 42 7.0 53 8.0 64 9.0 75 10.0 86 Referenz-Bereich: 4.0 – 6.0 % 20 – 42 mmol/mol Medizinische Analytik SS 2009

für Ihre Aufmerksamkeit INSTAND e. V. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

ß-Kette von verschiedenen Hämoglobinen (N-Term. AA 1-9) Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser HbA Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbS Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbC Gly-His-Phe-Thr-Glu-Glu-Asp-Lys-Ala HbF 1 3 6 9 AA

INSTAND e. V.

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