Validierung von Analysenmethoden

Grundlagen Analytische Ergebnisse haben oft weitreichende Konsequenzen. Die Untersuchungen müssen demnach mit nachweislich geeigneten Methoden durchgeführt werden. Die Validierung ist der Nachweis der Gebrauchstauglichkeit.

Was bedeutet Validierung EN/IEC 17025: „Eine durch Überprüfung erlangte Bestätigung, dass alle Voraussetzungen für eine beabsichtigte Anwendung erfüllt sind“ „Ein Prozess der feststellt, dass eine Methode geeignet ist“ Validierung einer Analysenmethode beinhaltet: Festlegung der analytisch/chemischen Anforderungen Bestimmung der Methodenparameter Überprüfung, dass die Methode die Anforderungen erfüllt Angabe der Gültigkeit

Ziel der Validierung Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten) Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung) Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen? Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

Ziel der Validierung Charakterisierung der Methodenperformance (Kenndaten) Umfang/Anwendungsbereich und Limitierungen Identifizierung von Faktoren die die Charakteristik der Methode ändern können (auch Ausmaß der Änderung) Welchen Analyten kann eine Methode in welcher Matrix in Gegenwart welcher Störungen bestimmen? Mit welcher Messunsicherheit geschieht das?

3 Milestones der ISO/IEC 17025 Validierung (validation) Basisvalidierung (für in-house Methoden und nicht normierte bzw. von der Norm abweichende Verfahren) Bestätigung (im Falle von über ÖNORM, ISO, EN, DIN etc. normierten Verfahren) Rückführbarkeit der Analysenergebnisse (tracebility) Unsicherheit der Analysenergebnisse (uncertainty)

Wozu? Sicherung der Qualität der Analysenergebnisse (im eigenen Interesse) Voraussetzung für Akkreditierung Juristisch abgesichert Forderung der Auftraggeber

Wann? Entwicklung einer Methode Änderung einer Methode Wenn Kontrollunterschungen zeigen, daß sich die Methode verändert hat Wenn eine anerkannte Methode in einer neuen Umgebung eingearbeitet werden soll.

Checklist Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt) Arbeitsbereich / linearer Bereich) Empfindlichkeit Selektivität, Spezifität Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze Eigenschaften des Analysenresultates Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI) Unsicherheit, unter Berücksichtigung von: Wiederfindung Robustheit Wiederholbarkeit Reproduzierbarkeit

Checklist Kenndaten der Analysenmethode (im Wesentlichen durch die Grundkalibrierung abgedeckt) Arbeitsbereich / linearer Bereich) Empfindlichkeit Selektivität, Spezifität Nachweisgrenze und Bestimmungsgrenze Eigenschaften des Analysenresultates Rückführbarkeit (z.B. auf das Internationale Einheitssystem SI) Unsicherheit, unter Berücksichtigung von: Wiederfindung Robustheit Wiederholbarkeit Reproduzierbarkeit

Arbeitsbereich Wird durch technische und praktische Erwägungen festgelegt und durch die Validierung bestätigt. (Meist bestimt durch den niedrigsten und höchsten Kalibrations Standard) NWG BG Arbeitsbereich beginnt frühestens bei der Bestimmungsgrenze und wird durch die Kalibrationsstandards festgelegt. Meist im linearen Bereich. Linearität muss für die Gültigkeit der statistischen Auswertung nachgewiesen werden. Arbeitsbereich

Empfindlichkeit (sensitivity) Ein Maß für die Signalauflösung eines Verfahrens. Steigung der Kalibrationsgeraden Differenz in der Analytkonzentration, die der kleinsten detektierbaren Signaldifferenz entspricht

Selektivität/Spezifität Selektivität bedeutet bis zu welchem Ausmaß eine Methode geeignet ist, einen Analyten in einer Matrix ohne Störungen der anderen Komponenten zu bestimmen. Spezifität bedeutet 100% Selektivität Die IUPAC empfiehlt diesen Begriff nicht zu verwenden, weil praktisch keine Methode spezifisch ist.

Selektivität Wägen LC LC-DAD LC/GC/CE-ICP-MS NAA LC-MS-MS-MS GC-MS-MS Photometrie ICP-AES, ICP-MS, AAS

Robustheit Beeinflussung der Leistungsfähigkeit bei (unvermeidlich) kleinen Änderungen bei der Durchführung des Analysenverfahrens.

Nachweisgrenze (limit of detection) (Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten) Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (b-Fehler = 50%). Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (a-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist.

Nachweisgrenze (limit of detection) (Entscheidungsgrenze für das Vorhandensein eines Analyten) Die Nachweisgrenze stellt den kleinsten Meßwert dar, der mit einer vorgegebenen Sicherheit vom Blindwert zu unterscheiden ist. Besitzt eine Probe genau diesen Gehalt des Analyten, so wird in 50% der Fälle der konkrete Meßwert kleiner als die Nachweisgrenze sein (b-Fehler = 50%). Erhält man bei einer Analyse Meßwerte im Bereich der Nachweisgrenze, kann mit der vorgegebenen Sicherheit (Signifikanz) von z.B. 99% entsprechend einer Unsicherheit von 1% (a-Fehler) davon ausgegangen werden, daß der Analyt vorhanden ist. Vorgegebene Sicherheit 3σ = 99.7% => NG = 3 x σ BW

Erfassungsgrenze (kleinste Konzentration eines Analyten, die mit hoher Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann – Untere Grenze für die Quantifiziernug eines Analyten) Um den b-Fehler der Nachweisgrenze zu verringern, wurde die Erfassungsgrenze eingeführt. Sie stellt den Meßwert dar, bei dem der b-Fehler gleich dem a-Fehler ist. Damit entspricht die Erfassungsgrenze dem 2 fachen der Nachweisgrenze. Unter Zugrundelegung eines a-Fehlers von 1% ist der Analyt auch hier, wie bei der Nachweisgrenze, mit einer Sicherheit von 99% nachgewiesen. Vorgegebene Sicherheit = 99.7% => EG = 2 x NG = 6 x σ BW

Rel. analyt. Unpräzision VBrel in % Bestimmungsgrenze (limit of determination) (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers) Die Analysenpräzision sollte über den gesamten Messbereich gleich groß sein. Die relative analytische Unpräzision (VB) nimmt mit sinkender Konzentration zu. Die BG entspricht jener Konzentration, ab der die geforderte Analysenpräzision (zumeist 33.3%) erfüllt ist. Rel. analyt. Unpräzision VBrel in % 33% XB Konzentration

Bestimmungsgrenze (limit of determination) (kleinste Konzentration eines Analyten, die quantitativ mit einem vorgegebenen relativen Fehler bestimmt werden kann – Untere Grenze für die Quantifizierung innerhalb eines bestimmten Fehlers) Im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze wird die Anwesenheit des Analyten vorausgesetzt. Über das die Kalibrationsgerade umschliessenden Vertrauensband errechnet sich der Bestimmungsfehler ± VB. VB ist in der Arbeitsbereichsmitte am kleinsten und steigt mit zunehmender Entfernung von der Mitte. Es gilt BG = k* VB, näherungsweise auch BG = k * NG. Die Bestimmungsgrenze bezeichnet den Konzentrationswert, bei dem der relative Fehler erstmals die vorgegebene Schranke der Ergebnisunsicherheit unterschreitet. z.B. k=3 entsprechend 33,3% Annähernd: BG ≈ 3.33 NG => BG = 10 x σ BW

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode Bestimmung erfolgt über das Blindwertrauschen (Blindwertstatistik) => Gültig für alle nicht kalibrierbare Methoden => Gute Annäherung für kalibrierbare Methoden Instrumenteller Blindwert (=> instrumentelle NG) Methodenblindwert (=> NG der Methde) Lineare Kalibrierfunktion (ohne Blankkorrektur) : y=kx + d sbl ... Standardabweichung des Blanksignals yNWG = Ybl + 3 sbl NWG = (yNWG – d)/k yBG = Ybl + 10 sbl BG = (yBG – d)/k

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode BW σ

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 3 x σ = NG BW σ

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 3 x σ = NG BW σ

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 3 x σ = NG BW σ NG

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 6 x σ = EG 3 x σ = NG BW σ NG

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 6 x σ = EG 3 x σ = NG BW σ NG EG

Bestimmung von NG/EG/BG - Blindwertmethode 10 x σ = BG 6 x σ = EG 3 x σ = NG BW σ NG EG BG

Bestimmung über die Kalibrationsgerade Bestimmung erfolgt über die Kalibrationsgerade bei kalibrierbaren Methoden (z.B. Mittels Software DIN Test©): Ausreisserkontrolle + Statistik (t-Test...) Bestimmung der NG/EG/BG über die Vertrauensbänder (Berechnung nach DIN 32645) Nachteil der Berechnung: Standards, aus denen die Kalibrationskurve erstellt wurde, müssen eigentlich dieselbe Probenvorbereitungsprozedur wie die Proben durchlaufen, um einen dem Methodenblank entsprechende NG/BG und EG zu ergeben. Standards sollten äquidistant in der Nähe der NG liegen. Bei nicht-linearer Kalibration: Gewichtung der Punkte

Bestimmung über die Kalibrationsgerade NG/EG/BG eines Verfahrens kann nicht aus einer einmaligen Kalibrierung ermittelt werden Bei einmaliger Kalibrierung dient die Berechnung der EG zur Überprüfung des unteren Arbeitsbereichsendes. Das untere Arbeitsbereichsende ist nur dann statistisch abgesichet, wenn EG kleiner als die Konzentration des niedrigsten Standards ist. Zur Ermittlung der EG aus der Kalibration wird mehrfach mit immer kleineren Standarkonzentrationen kalibriert. Liegt die berechnete EG im Bereich der niedrigsten Standardkonzentration, wird das Ergebnis als EG genommen.

Angabe von Analysenergebnissen lt. DIN 32645 x < NG: nicht nachgewiesen (mit NG), Höchstgehalt EG NG < x < EG: nachgewiesen, nicht quantifizierbar EG < x < BG: quanitifzierbar EG < x < BG: Gehalt mit Konfidenzintervall bzw. Messunsicherheit NG und BG müssen für jede Probenart (Matrix) separat ermittelt bzw. angegeben werden und dürfen sich nicht nur auf Standardlösungen beziehen. Beim Vergleich der NG und BG verschiedener Laboratorien ist es wichtig, wie diese Parameter ermittelt worden sind und auf welche Matrix sich diese beziehen. Für „worst case“-Betrachtungen von Werten unter der NG (n.n. Werte) kann gemäßDIN 32645 die Erfassungsgrenze als möglicher Höchstgehalt herangezogen werden.

Beispiel Bei der Bestimmung von Pb in Trinkwasser mittels ICP-MS wurde eine Kalibrationsgerade von I[cps] = 75000 x c[ng g-1] (nach Blank Korrektur). Für den Blank wurden nun folgende Intensitäten gemessen: 1520; 1340; 1850; 1250; 1670 cps Berechnen Sie die NG/EG/BG dieser Messung.