Mikrobiell-serologische Untersuchungen Immunchemische Verfahren zum Nachweis von Antigen bzw. Antikörper und Stufenschema der Toxoplasmose Diagnostik Prof. R. R. Reinert

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Indikationen zur Serologischen Untersuchung Der direkte Erregernachweis ist in der Regel vorzuziehen ! Aber einige Erreger sind: Nur schwer anzuzüchten Die Anzucht dauert zu lange Beispiele Viren Toxoplasmose Lues

Mikrobiell-serologische Untersuchungsmethoden Direkter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern in der mikrobiellen Serologie Direkte Agglutination (Gruber-Widal-Reaktion) Immunpräzipitation (Immundiffusionsverfahren) Indirekter Nachweis von Antigenen oder Antikörpern in der mikrobiellen Serologie Latexagglutination Indirekte passive Hämagglutination (IHA, indirekte Hämagglutination) Komplement-Bindungsreaktion (KBR) Assays mit Markierung eines Reaktionspartners Immunfluoreszenztest (IFT) Immunoassays (z.B. ELISA)

Erreger prä- und perinataler Infektionen I (S)ToRCH: (Syphilis) Toxoplasma gondii other infectious microorganisms Rötelnvirus Cytomegalievirus Herpes-simplex-Virus

Erreger prä- und perinataler Infektionen II Viren Varizella-Zoster-Virus (VZV) Parvovirus B19 Masernvirus Hepatitisviren (HBV, HCV, HGV) HIV 1 / 2 Papillomavirus Bakterien Listeria monocytogenes Streptococcus agalactiae Neisseria gonorrhoeae Chlamydia trachomatis Mycoplasma hominis / Ureaplasma urealyticum

Syphilis Syphilis auch Lues harter Schanker Franzosenkrankheit Ansteckende Geschlechtskrankheit, die von Treponema pallidum verursacht wird Syphilis wird bei sexuellen Handlungen durch Schleimhautkontakt von Mensch zu Mensch übertragen Während der Schwangerschaft und bei der Geburt kann eine erkrankte Mutter ihr Kind infizieren (Syphilis connata)

Lues connata Die Treponemen sind ca. ab der 20. Schwangerschaftswoche plazentagängig Als Folge hiervon kann es entweder zur Fehl- oder Frühgeburt kommen, oder aber das Kind kommt mit einer angeborenen Syphilis, der Lues connata, zur Welt. Wird diese vor dem 2. Lebensjahr symptomatisch, so spricht man von der Lues connata praecox (übers.: vorzeitige angeborene Lues). makulopapulöses (übers.: fleckig; an den Haaransätzen kleine Knötchen) Exanthem plattenförmige Hautveränderungen Hepatosplenomegalie blutiger Schnupfen. Bei Symptomen nach dem 2. Lebensjahr spricht man dagegen von der Lues connata tarda Hutchinson-Trias Hornhautentzündung (Keratitis) Innenohrschwerhörigkeit Tonnenförmige Schneidezähne Zusätzlich kann eine sog. Sattelnase auftreten.

Syphilis

Lues connata

Toxoplasmose

Toxoplasmose in der Schwangerschaft

Toxoplasmose in der Schwangerschaft Frauen, die einmal eine Toxoplasmose-Infektion hatten, haben Antikörper im Blut und sind normalerweise gegen eine Ansteckung immun - es besteht kaum Gefahr für den Fötus Eine erstmalige Erkrankung der Mutter im ersten oder zweiten Drittel einer Schwangerschaft kann zu erheblichen Schädigungen des ungeborenen Kindes führen. Die Wahrscheinlichkeit der kindlichen Infektion beträgt im 1. Trimenon 15 % 2. Trimenon 45 % 3. Trimenon 65-70 %

Toxoplasmose in der Schwangerschaft Im ersten Trimenon entwickeln 70 % der infizierten Kinder eine konnatale Toxoplasmose, die meist zur Fehlgeburt führt. Im zweiten und dritten Trimenon entwickeln 30 bzw. 10 % eine konnatale Toxoplasmose Die infizierten Kinder können epileptische Anfälle kognitive Einschränkungen Schäden an der Leber Lunge Gehirn Augen Herzmuskel Hirnhaut

Toxoplasmose in der Schwangerschaft Die typische Trias bestehend aus Hydrozephalus intrazerebraler Verkalkung Chorioretinitis Wird jedoch nur bei 2 % der Betroffenen ausgeprägt.

Virusinfektionen in der Schwangerschaft Klinik nach Infektionszeitpunkt Embryopathie Fetopathie perinatale Infektion Röteln Abort, Gregg-Syndrom Frühgeburt, Hepatosplenomegalie, Encephalitis nicht bekannt Cytomegalie Abort, Hepatosplenomegalie, Encephalitis Parvovirus B19 Abort Hydrops fetalis Masern Herzfehler* Frühgeburt Mumps Abort* HSV 1 / 2 Mikrocephalus* Frühgeburt / Fruchttod generalisierte HSV-Infektion, Encephalitis VZV Augenmißbildungen* generalisierte Varizellen, Encephalitis Poliomyelitis Fruchttod * in Einzelfällen

Röteln Erreger ist das Rötelnvirus. Es gehört zur Familie der Togaviridae Behülltes Einzelstrang[+]-RNA Virus Man bezeichnet den Erreger auch als Rubellavirus.

Röteln Inkubationszeit: 14 bis 21 Tagen Es bilden sich zunächst im Gesicht gerötete, einzelstehende Hauteffloreszenzen Stamm Extremitäten Erhöhte Temperatur bis 39 Grad Celsius Gliederschmerzen Arthritis Lymphknotenschwellung am Hinterkopf Nacken HSM

Röteln

Röteln in der Schwangerschaft In den ersten sechs Wochen der Schwangerschaft führt eine Rötelninfektion in 65 % der Fälle zur Erkrankung des Fetus Mit fortschreitender Schwangerschaft sinkt das Risiko der Erkrankung Die Folge einer Infektion des Fetus sind regelmäßig Fehlbildungen Innenohrschwerhörigkeit Herzfehler, Gefäßfehlbildungen (offener Ductus Botalli, Septumdefekte und Fallot'sche Tetralogie) Spina bifida aperta Enzephalomeningitis Daher gehört die Untersuchung auf Röteln zur Mutterschaftsvorsorge

Testverfahren In der Vorlesung Im Praktikum Elisa HHT KBR IFT Direkte Agglutination Immundiffusion

Elisa Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest (EIA) bzw. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immunologisches Nachweisverfahren Radioimmunoassay (RIA): Radioaktivitätsmessung Enzymatische Farbreaktion Nachweis von: Proteine Viren Niedermolekulare Verbindungen Hormone Toxine Pestizide

ELISA (Sandwich) 3. Inkubation 2. Inkubation 1. Inkubation Spezifischer humaner Antikörper Mikrotiterkavität mit Antigen beschichtet Mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Human-Antikörper AP Chromogenes Substrat Chromogener Farbstoff 1. Inkubation 2. Inkubation 3. Inkubation

Elisa

Sandwich Elisa (Verstärkungssysteme)

Elisa Systeme

Elisa-Systeme

Hämagglutination

Hämagglutinationshemmtest (HHT) Bestimmte Bakterien und Viren bilden Hämagglutinine ( = Stoffe die Ery´s agglutinieren können). Befinden sich im Untersuchungsmaterial  spezifische Antikörper gegen ein Hämagglutinin, so kommt es nach AG Zugabe zu einer AG - AK - Reaktion. Diese wird dadurch sichtbar, daß danach zugegebene Erythrozyten nicht mehr agglutiniert werden. Die Reaktion wird gehemmt : Hämagglutinin - Hemmung )

Komplementbindungsreaktion Allgemeines: Indirektes Verfahren zum Antikörpernachweis, technisch aufwendig Wegen der Vielfalt der Reaktionsteilnehmer relativ störanfällig IgG- und IgM-Nachweis (Differenzierung nicht möglich) Hohe Spezifität und (im Vergleich zu anderen Verfahren, z.B. EIA oder IFT) geringe Sensitivität

Komplementbindungsreaktion Diagnostische Bedeutung: Vorwiegende Anwendung zur bakteriellen und parasitären Infektionsdiagnostik V.a. Erkennung von Infektionen im Frühstadium (mit hohen Titern erregerspezifischer IgM-Antikörper) Heilungsverlauf (z.B. Cardiolipin-KBR unter Luestherapie)

Komplementbindungsreaktion Testvoraussetzungen: Steriles Serum (mögliche antikomplementäre Wirkung durch bakt. Verunreinigung !) Vor Testbeginn: Hitze-Inaktivierung des Patientenserums zur Eliminierung patienteneigenen Komplements (30 min. 56°C) Strikte Einhaltung bestimmter quantitativer Beziehungen der einzelnen Reaktionspartner zueinander

Komplementbindungsreaktion

Komplementbindungsreaktion

Komplementbindungsreaktion Merke: wurde das Komplement verbraucht (AK vorhanden) tritt keine Zelllyse ein. Es entsteht ein Knopf.

KBR

Toxoplasmose- Serodiagnostik Stufendiagnostik iIFT (Indirekte Immunfluoreszenz) IgG- oder IgM-Nachweis ELISA (Enzyme linked Immuno-Sorbent Assay) ISAGA (Immuno-Sorbent-Agglutination Assay) IgM-Nachweis Hochspezifisch Aviditätstest IgG-Reifebestimmung

Immunfluoreszenszenz

Nachweis von Toxoplasma gondii Antikörpern im indirekten Immunfluoreszentest (iIFT)

(Immunosorbent Agglutination Assay) Toxo-ISAGA (Immunosorbent Agglutination Assay) 2-stufige Reaktion: 1. Humane IgM-Antikörper im Serum binden an die monoklonalen anti-human Antikörper in den Kavitäten 2. Spezifisches Toxoplasma IgM wird durch Zugabe von mit Formalin behandelten Toxoplasmen nachgewiesen Negativ: Sedimentation der Toxoplasmen Positiv: Schleierbildung durch Agglutination der Toxoplasmen

Extinktion ohne Harnstoff Meßung der Avidität Die Aviditätsbestimmung beruht auf einer Herabsetzung der Bindungsstärke der Antigen-Antikörper-Bindung durch ein mildes Protein-denaturierendes Reagenz, meist Harnstoff. Dabei werden nur die Antigen-Antikörper-Komplexe niedrig-avider Antikörper dissoziiert (getrennt), Antigen-Antikörper-Komplexe hoch-avider Antikörper bleiben unbeeinflußt. Extinktion mit Harnstoff % Aviditätsindex = ------------------------------------- x 100 Extinktion ohne Harnstoff

IgG Avidität Toxoplasma Interpretation Index < 0,200 IgG mit niedriger Avidität 0,200 < Index 0,300 Mittlere Avidität Index > 0,300 IgG mit hoher Avidität (frische Infektion älter als 4 Monate)

Ziel erreicht? Wichtigsten serologischen Testsysteme kennen Bedeutung der Serologie in der Storch Diagnostik

Vielen Dank für die Aufmerksamkeit Und…… Viel Spaß im Praktikum