A und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-Brücken D-R 5´ 3´ D-R P 5´ 3´ D-R P 5´ 3´ In der Zelle formt die DNA eine Doppelhelix mit zwei antiparallelen Ketten Das Rückgrat jeder Kette ist der Phosphate (P)-----Desoxyribose (D-R) -Strang Die Basen sind wie Rippen an diesem Rückgrat angeordnet, und jeweils an die Desoxyribosen gebunden Die beiden Stränge sind antiparallel angeordnet 5´ 3´ 3´ 5´ Die beiden Stränge treten entlangen der Basen zusammen und werden zusammengehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen A und T bilden ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C bilden ein Basenpaar mit 3 H-Brücken

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen

Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen 0.27-0.31 nm biologisch releveant 12 - 29 kJ/mol

Ausbildung der Watson::Crick Basenpaare innerhalb der DNA-Doppelhelix 5´ 3´ H-Brücken Regeln bei der Watson-Crick-Basenpaarung die beiden DNA-Stränge treten entlang der Basen zusammen und werden zusammen- gehalten durch (i) Wasserstoffbrücken-Bindungen (ii) hydrophobe Wechselwirkungen die Basen auf den gegenüberliegenden Strängen stehen sich exakt gegenüber A und T ein Basenpaar mit 2 H-Brücken G und C ein Basenpaar mit 3 H-Brücken die Basen sind planar gebaut > Stapelung der Basenpaare in der Doppelhelix (´base stacking´)

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung G = C A+G = T+C A = T

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

Die DNA-Doppelhelix Strukturprinzip der Doppelhelix das Desoxyribose-Phosphat- Rückgrat bildet eine Helix-Struktur aus die Basen sind zum Innern der Helix gekehrt und die Desoxyribose/Phosphat- Reste liegen an der Außenseite die Ringebenen der Basen stehen senkrecht zur Helixachse die Zucker stehen fast im rechten Winkel zur Base die genetische Information liegt in der Abfolge der Basenpaare TAGCGT Leiter-Modell Ribbon-Modell

Die Struktur der DNA-Doppelhelix Raumfüllendes Kalottenmodell 1. Strang (5´) 2. Strang (3´) große Furche kleine Furche DNA-bindende Proteine können spezifisch an die DNA binden. Dabei lagern sich die Proteine in die große bzw. kleine Furche ein und bekommen dadurch Zugang zu den Basen. Dadurch ist die Erkennung einer spezifischen Basenabfolge möglich (z. B. Transkriptionsfaktoren, Restriktionsenzyme) rote Linien verbinden die Phosphat-Reste

Rechtsläufige Doppelhelix Entspricht 99% der zellulären DNA GCGCGCGC Abfolge Zick-Zack Verlauf des Phosphodiester-Bandes Linksläufige Doppelhelix Entsteht bei drastischer Abnahme des Wassergehalts Rechtsläufige Doppelhelix Basenpaare nicht senkrecht wie bei B-Form, sondern um 70° gekippt Offener Raum im Molekülinneren

Zusammenfassung der DNA Struktur

Die Verdopplung der DNA 1953 haben Watson & Crick die drei-dimensionale Struktur der DNA -Doppelhelix aufgeklärt und sofort den Mechanismus der DNA-Replikation vorhergesagt

Die DNA-Replikation wichtig ist, daß die genetische Information (= Abfolge der Basensequenz in der DNA-Kette) während der Zellteilung exakt von der Mutterzelle auf die Tochterzelle übertragen wird Fehler können sich kastastrophal auf die Lebensfähigkeit der Zelle auswirken, oder Krebs entstehen lassen bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze

bei der Verdopplung fungieren beide Elternstränge der doppelsträngigen DNA als Matritze

Semi-Konservative DNA-Replikation Identische Verdopplung Reißverschlußartige Trennung der beiden Elternstränge entlang der Basenpaare = Brechen der H-Brücken

Semi-konservative DNA-Verdopplung Meselson & Stahl Parentale DNA- Doppelhelix DNA-Moleküle nach einer Runde der Replikation Konservative A1 A2 Semi-Konservative N1 N2 Semi-konservative DNA-Verdopplung wurde durch Watson & Crick (1953) vorhergesagt, aber erst durch ein klassisches Experiment (1959) bewiesen von Meselson & Stahl

Der semi-konservative Replikationsmechanismus wurde zunächst für E. coli gezeigt, und später für alle Organismen einschließlich Homo sapiens bewiesen

„Leichte DNA“ „Schwere DNA“ Rückführung der Bakterien in Verfüttern von 15N-Stickstoff Nährmedium an E. coli DNA enthält normalen = leichten 14N-Stickstoff E. coli „Leichte DNA“ DNA enthält jetzt ausschließlich schweren 15N-Stickstoff „Schwere DNA“ Rückführung der Bakterien in 14N-Stickstoff-Nährmedium für eine Verdopplungszeit von 20 min Anschließende Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation

Experimentelle Befunde Analyse der DNA ob schwer, leicht oder Hybrid durch CsCl-Dichtegradientzentrifugation S-S S- L L-L Semi-konservativ konservativ Mögliche Ergebnisse Experimentelle Befunde (Meselson & Stahl, 1958) Wachstum in 15N-Medium Schwere DNA (schwer = S) S-S 1. Verdopplung mit 14N-Stickstoff (leicht = L) S-L L-L S-L 2. Verdopplung mit 14N-Stickstoff (leicht = L)

Das Beweis-Experiment, daß auch eukaryontische DNA semi-konservativ repliziert wird Dazu wurden Wurzelzellen mit [3H]-Thymidin (radioaktiver Wasserstoff!) durchmarkiert, isoliert und anschließend autoradiographisch untersucht Röntgen-Film mit AgBr-Emulsion e- Radioaktiv-markiert Probe (z. B. [3H]-Thymidin-markiertes Chromosom) beim b-Zerfall des Tritiums werden Elektronen frei, die den Röntgenfilm an den Stellen schwärzen (Ag-Körner), an denen die Chromosomen auf dem Film aufliegen. Genauigkeit der Lokalisierung: ca. 0.5 - 1.0 mm Objektträger

…….semi-konservative Replikation von eukaryontischer DNA in Wurzelzellen A1 A2 A1 N1 A2 N2 2n Teilung DNA-Replikation in nicht-radioaktivem Medium DNA-Synthese in radioaktivem Medium [3H]-Thymidin 1n 2n beide Schwester- Chromatide sind markiert Autoradiographie-Bild nur ein Schwester- Chromatid ist markiert Autoradiographie-Bild

Die DNA-Replikation erfolgt bi-direktional Replikationsgabel Die Replikation der DNA erfolgt nicht spontan, sondern wird durch Enzyme (DNA-Polymerasen) katalysiert Grundsätzlich gilt, daß die DNA-Polymerasen die Replikation nicht an jeder beliebigen Stelle der DNA initiieren, sondern nur am Replikations-Startpunkt = “Origin“

rechte Wachstumsgabel am häufigsten findet man, daß die Replikation am Origin beginnt und sich von dort bi-direktional forstsetzt dadurch entstehen 2 Replikationsgabeln rechte Wachstumsgabel linke Wachstumsgabel Wachstum in beide Richtungen bei ringförmiger DNA (z. B. E. coli) genügt meist ein Origin. Die beiden dort entstehenden Replikationsgabeln verschmelzen schließlich auf der gegenüberliegendenen Seite des Origins nach erfolgter Replikation Ende der Replikation

die langen, linearen eukaryontischen Chromosomen (= lineare DNA) haben viele DNA-Replikations-Startpunkte (vermutlich einige tausende bis zehntausende Origins beim Menschen) die bi-direktionalen Replikationsgabeln bewegen sich aufeinander zu, solange bis sich benachbarte Startpunkte begegnen durch das Vorhandensein von vielen Replikons (Replikations-Startstellen) schafft es die eukaryontische Zelle die ca. 1000-fach größere DNA (vgl. E. coli > Mensch) in der erforderlichen Zeit zu replizieren

Der Nachweis der bi-direktionalen DNA-Replikation wurde durch Autoradiographie von radioaktiv markierter DNA, die aus Säugerzellen isoliert wurde, erbracht. Markierung der DNA erfolgte mit [3H]-Thymidin, zunächst von niedriger Radioaktivität.Nach Beginn der Replikation wurde die Menge an radioaktivem [3H]-Thymidin erhöht. Anschließend wurden die Chromsomen autoradiographiert. Ori 1 Ori 2 Autoradiogramm hohe niedrige hohe Radioaktivität e- [3H]-markierte DNA

Sichtbarmachen von Replikationsblasen 1n DNA Replikationsblase 2n DNA Replikationsgabel Elektronenmikroskopische Aufnahmen von sich replizierender DNA aus Drosophila-Zellen, die sich rasch teilen (= aktive DNA-Replikation). Die Pfeile zeigen Replikationsblasen, in denen bi-direktionale Replikation stattfindet.

Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln Zellen werden unterschiedlich lang mit [3H]-Thymidin markiert, bevor die DNA isoliert und autoradiographisch analysiert wird durch die Länge der Schwärzung auf dem Röntgenfilm kann die Geschwindigkeit, mit der sich die Replikationsgabel entlang der DNA bewegt, bestimmt werden hohe niedrige hohe Radioaktivität OriC t1 t2 t3 Länge der radioaktiv markierten DNA (mm) in Abhängigkeit der Replikationsdauer

Wanderungs-Geschwindigkeit der Replikationsgabeln Länge der DNA auf dem Autoradiogramm proportional zur Anzahl der replizierten Basenpaare > Bestimmung der Replikationsgeschwindigkeit = 1000 BP/sec/Gabel bei E.coli Kleine Rechnung bei E. coli dauert die Replikation 20 min (Genomgröße = 3 x 106 BP) bei 2 Replikationsgabeln mit einer V = 1000 BP/sec stimmen theoretischer und errechneter Wert überein 1200 sec x 1000 BP = 1.2 x 106 BP bei 2 Gabeln: 2.4 x 106 BP Homo sapiens ~ 100 BP/sec/Gabel (Autoradiographie) bei 3 x 109 BP/Genom benötigt man ca. 1000 Replikationsgabeln für die Replikation des gesamten Genoms (in ca.10 hr)

Wie funktioniert der einzige “Origin of Replication“ in E. coli? OriC DnaA (ATPase) Startkomplex 30°C DnaB = Helikase DnaC ATP Erkennung Offener Komplex leichtes „Schmelzen“ der DNA „Prä-Priming“ Komplex - Primase - DNA-Polymerase Replikation