”Vaccines” Regulation of acquired immune responses during infection with intracelllular bacteria ”Vaccines”
Geschichte der Vakzinierung: eine Erfolgsgeschichte ! Vor und nach Einführung des Impfstoffes (CDC seit 1912) Polio 100 % (USA, Westeuropa) Pocken 100 % (weltweit) Masern/Mumps/Röteln 99 % (USA) Diphtherie 99 % (USA, Westeuropa) Keuchhusten 97 % (USA) Vor und nach Einführung des Impfstoffes (UK seit 1999) Neisseria meningitidis C 92 % (Kleinkinder) 95 % (Heranwachsende) Salmonella Vi Konjugat 90 % (2 - 4 jährige Kinder) Sicherheit ? Masern-Enzephalopathie 1/1000 natürliche Infektion 1/1.000.000 Impfung
Die drei größten Killer in Millionen (Jahr 2000) 2.3 AIDS 1,7 TB 0.5 TB/HIV 1.2 Malaria
Dringend benötigte Impfstoffe: HIV Tuberkulose Malaria Hepatitis C Chlamydien Helicobacter pylori Leishmaniose Filariose Schistosomiasis (Bilharziose) Papilloma Virus Rotaviren (Durchfallerkrankungen) Respiratorisches Synzytienvirus (RSV), Rhinoviren u.v.a. Nicht nur Infektionskrankheiten Tumorvakzine Alzheimer
Neue Ansätze zur Impfstoff-Entwicklung ► Memory/Immuologisches Gedächtnis ► Wirksamkeit von Vakzinen Nachweis von Immunantworten ► Neue Strategien zur Verbesserung alter und zur Entwicklung neuer Vakzine !
Memory/Immunologisches Gedächtnis ► B-Zell-Memory - Antikörper - Memory-B-Zellen - Plasmazellen ► T-Zell-Memory - CD4 Th-Zellen - CD8 T-Zellen
B-Zellen/Antikörper ► mit wenigen Ausnahmen beruhen alle zur Zeit verwendeten Impfstoffe auf der Induktion von B-Zellen/Antikörpern ► Antikörper sind relativ leicht induzierbar ► Die Induktion und Wirksamkeit von Antikörpern lässt sich relativ einfach testen. -> Nachweis der Wirksamkeit der Vakzine
B-Zell-Memory/Antikörper: Nachweis einer B-Lymphozytenantwort ► Qualitativer und quantitativer Nachweis von spezifischen Antikörpern • ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) • Western-Blot • Neutralisierungstests ► Nachweis der antikörperbildenden Zellen • Plaquetest • ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay)
Memory-T-Zellen Verschiedene Memory-T-Zellsubpopulationen ► CD4, CD8 ► CD4 Th-Zellsubpopulationen (Zytokin-Profil) - Th1, Th2, Th17…. ► Memory-T-Zellsubpopulationen - central Memory T-Zellen - effector Memory T-Zellen ► Expression von (hemmenden) Co-Rezeptoren ► Lokalisation der T-Zellen - Lunge, Darm…. Welche dieser Populationen schützt ??
Central vs Effector-Memory T-Zellen CD4 CD4 CD8 Sallusto et al, Science 1999
Central vs Effector-Memory T-Zellen Central Effector CCR7 ++ - CD62L ++ +/- Gewebe Lymphgewebe Peripherie Proliferation ++ +/- Effektorfunktion +/- ++ Cosignale ? - Lebensdauer + ?
Methoden zur Analyse der erworbenen T-Zellantwort Problem: Kein Antigen-spezifisches, den Antikörpern vergleichbares und einfach messbares Zellprodukt vorhanden!
Qualitative Nachweismethoden für T-Zellen (z.T. semi-quantitativ) in vitro • Proliferation und Zytokinproduktion nach Stimulation mit dem Antigen • Zytotoxizität • Limitierende Verdünnungskultur (Limiting Dilution Assay) • T-Zellklonierung und Analyse der individuellen Klone in vivo • DTH Reaktion (Tuberkulin-Test) • Bestimmung der schützenden Immunität “Infektionsexperimente“
Neuere Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse der T-Lymphozyten-Antwort • ELISPOT-Assay • Intrazelluläre Zytokinfärbung nach kurzer Antigenstimulation • MHC/Peptid-Komplexe (Tetramere)
Klassisches Beispiel einer Delayed-Type-Hypersensitivity-Reaction: Tuberkulin-Test Fig. 12.25 Janeway
Zytokintest
Tag nach einer Infektion mit Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) 100 naiv 80 immunisiert mit einem attenuierten S. typhimurium-Stamm 60 40 20 20 40 60 80 Tag nach einer Infektion mit S. typhimurium (400 i.v.)
Bestimmung der schützenden Immunität (Infektionsexperimente) -> Große Impfstudien können auch als Infektionsexperiment angesehen werden
ELISPOT-Assay (enzyme-linked immunospot assay) Methode: APC * T APC * anti-IFNg-Antikörper + T-Zellen + APC +Antigen 24h E E E E E Entfernen der Zellen Substrat anti-IFNg-Antikörper -Enzymkomplex
ELISPOT-Assay Beispiel - - ohne Antigen IFN-g+ Spots/105 Zellen mit 250 ohne Antigen 200 150 IFN-g+ Spots/105 Zellen 100 50 mit Antigen - Antigen - Antigen naiv infiziert
FACS: Intrazelluläre Zytokinfärbung Prinzip: Blockade der Zytokinsekretion (Brefeldin A) Fixierung und Permeabilisierung der Zellen intrazelluläre Zytokinfärbung mit Antikörpern
Intrazelluläre Zytokinfärbung Beispiel: Inkubation FACS CD8 T T T T APZ APZ APZ APZ extra- und intrazelluläre Färbung IFN - g IFN - g CD8 T T T T APZ APZ APZ APZ 4h
Multizytokin-Produzenten
MHC Klasse I-Tetramere Prinzip H-2Kd Peptid (LLO91-99) PE Streptavidin b2-Mikroglobulin Biotin PE Streptavidin CD8 TZR
L. monocytogenes-Infektionsmodell Primärinfektion (103 i.v.) Titer Sekundärinfektion (105 i.v.) 1 2 Wochen
L. monocytogenes-Infektionsmodell Primärinfektion Tag 0 Tag 4 Tag 7 Tag 10 Tag 17 0,02 0,14 2,22 3,11 1,41 Sekundärinfektion Tetramer PE 0,36 1,48 20,05 9,44 Tag 0 Tag 3 Tag 5 Tag 7 CD62L FITC Epitop: Listeriolysin O Peptid 91-99
HIV-Infektion anti-viral Therapy 3 107 106 2 105 HLA-B27-gag 263-272 staining (%) Viral load (copies per ml) 104 1 103 102 100 200 300 400 Days after HIV infection McMichael and Rowland-Jones, Nature 2001 410:908
Akute Infektiöse Mononukleose (Epstein-Barr-Virus) Callan et al. JEM 1998 187:1395
Grundlagenforschung und Vakzine-Entwicklung: Biologie der Immunantwort: Welche Immunantwort schützt? (Welche führt zu Pathologie?) Tiermodelle zur Testung Korrelat für Schutz im Menschen. Biologie des Erregers: Lokalisation im Wirt, in der Wirtszelle? Virulenzfaktoren, Attenuierung (Abschwächung) Impfstoff-Kandidatenauswahl. - Genome, Proteome. - Welche Antigene macht der Erreger im Wirt?
“Correlates of protection“ Hauptproblem: Wie sieht eine schützende Immunantwort überhaupt aus? “Correlates of protection“
Correlates of protection Für wichtige Krankheitserreger ist unklar wie eine schützende Immunantwort aussieht! ► B-Zellen und/oder T-Zellen? ► Zielstrukturen/Antigene für T- und B-Zellen? ► Quantität der Memory-T-Zellen? ► Qualität der Memory-T-Zellen? - Zytokinprofil (multi-Zytokinproduzenten) - Oberflächenmoleküle - Langlebigkeit - Effektorfunktionen/Proliferation
Neue Strategien: 1. Subunit-Vakzine: - rekombinante Proteine - Peptide, Peptide-Agglomerate 2. Lebend attenuiert: gezielte Eliminierung von Virulenzfaktoren 3. Lebend rekombinant: - Antigene (Eigen-, Fremd-) - Zytokine (IL-12, GM-CSF) - Zytolysine (Listeriolysin) 4. DNA: Antigene, Zytokine, CpG-Motive 5. Neue Adjuvantien 6. Prime-Boost-Ansätze
+ - Subunit-Vakzine rekombinante + - rekombinante Proteine sicher, definiert, stabil wenig immunogen richtige Konformation keine CD8 T-Zellen (B-Zellen) -> Lipoproteine, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate Peptide sicher, definiert, stabil wenig immunogen billig keine CD8 T-Zellen Konformation (B-Zellen) MHC (Impflöcher) -> Lipopeptide, Adjuvantien, Polysaccharidkonjugate, Choleratoxoid-Konjugate, Polypeptide mit Schnittstellen für Proteasomen
+ - Attenuierte (rekombinante) Lebend-Vakzine Lebend/ ähnlich der Infektion, Entzündung attenuiert immunogen, Gedächtnis, Sicherheit mukosale Immunität, Immunsuppression Persistenz, Reversion multivalent Rekombination immunstimulatorisch lange Erfahrung (Vaccinia, Adenoviren, BCG, Salmonellen) -> Expression rekombinanter Fremdantigene, Zytokine; Prime/Boost Vakzinierung
- + Nackte DNA Vakzine Nackte Persistenz, ähnlich Sicherheit ? DNA der Infektion, Einbau billig, haltbar CD4, CD8 T-Zellen, B-Zellen Zytokingene CpGs: hohe konzentrationen nicht-methylierter Motive Aktivierung von TLR-9 -> TH1 -Antwort
+ - Adjuvantien Adjuvantien Depoteffekt Entzündung alle Prozessierungswege Immunstimulation Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat ISCOMs, Saponin, Mannosepolymere Öl in Wasser, Liposomen Virus-like Particles Lipid A Cholera-Toxoid (B-Untereinheit)
Prime-Boost-Vakzinierung McShane et al. Nat. Med. 2004 10:1240
Prime-Boost-Vakzinierung TB reactive T-Zellen
Ist eine Impfung möglich? Tuberkulose Ist eine Impfung möglich?
Tuberkuloseerreger leben in Wirtsmakrophagen Mykobakterien T-Zellen schützen gegen Tuberkulose-Erreger
# wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff 1927: Der Impfstoff M. bovis Bacille-Calmette-Guerin (BCG) attenuierte M. bovis-Stamm Léon Charles Albert Calmette (1.7.1863 - 29.10.1933) Jean-Marie Camille Guérin (22.12.1872 - 9.6.1961) # wahrscheinlich der am häufigsten verwendete Impfstoff # zunehmender Wirkungsverlust!!
Listerien entweichen ins Zytoplasma der Zelle: Listeriolysin Listeria monocytogenes O min 20 min
Schutz durch einen gentechnisch veränderten Impfstamm: rBCGureC-Hly Aerosol Infektion mit dem Beijing Stamm in der Maus. ungeimpft BCG BCG ureC Hly Grode et al. JCI 2005
Verschiedene Vakzinierungsstrategien gegen SIV gag in Rhesusaffen
CD4 Zellen viral load
McElrath et al. Lancet 2008
Die Bill-und-Melinda-Gates-Stiftung gibt ihnen mehrere Millionen Euro zur Impfstoffentwicklung. Wie gehen sie vor?