Humorale Immunität V. Produktion protektiver Antikörper Immunologie für Studierende der Biologie & Molekularmedizin Konzepte der Immunologie Erlangen  WS 2007/2008 Humorale Immunität V. Produktion protektiver Antikörper Hans-Martin Jäck Division of Molecular Immunology Department of Internal Medicine III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum University of Erlangen-Nürnberg Universitätsklinikum Erlangen

Periphäres lymphatisches Organ PRODUKTION PROTEKTIVER AK Knochenmark Prä-BZR IgM Stammzelle Pro-B-Zelle Prä-B-Zelle Unreife B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle IgG IgM IgD +Ag +TH Plasma- zelle Naive, reife B-Zelle IgM, IgA, IgG, IgE Periphäres lymphatisches Organ

PRODKUKTION PROTEKTIVER AK Adult BONE MARROW (Primary Ab repertoire) mature B IgG IgM IgD PERIPHERAL LYMPHATIC ORGAN (Modified secondary repertoire) memory B plasma cell Ag + TH IgM Stem cell pro-B pre-B immature B Affinity maturation Somatic hypermutation of V exons Selection of high-affine BCRs IgH class-switch V(D)J rearrangement (RAG) Selection of functional IgR lat. reperire dt. finden V-Repertoire (Diversity) V-Repertoire (Affinity) CH-Repertoire (Effector)

Antigen-abhängige B-Zellaktivierung IgA IgG, IgA, IgE Molekulare Merkmale: IgM/IgD-Koexpression IgMmem → IgMsec Ig-Produktion ↑ IgH-Klassenwechsel IgM IgG IgM Plasma- zelle Ag IgD Naive B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle

Humorale Immunität +/- TH Keimzentrum +TH (Spezifität) Antikörper (IgM) Antigen (Antikörper generierend) Kurzlebige Plasmazelle Gedächtnis- B-Zelle (IgG, IgA, IgE) B-Zell- Rezeptor (IgM) +/- TH Keimzentrum Somatische Mutation Selektion IgH-Klassen- wechsel Gedächtnis +TH Langlebige Plasmazelle (IgG, IgA, IgE) B cell clone Primäres B-Zell- Repertoire (Spezifität) Klonale Expansion Differentiation

Ko-expression von IgM und IgD Reife B-Zelle IgM Unreife B-Zelle IgD Knochenmark Peripherie Genetischer Mechanismus: Differentielles Spleißen einer gemeinsamen Prä-mRNA Aus Janeway

Umschaltung auf Ig-Sezernierung 1 B-Zelle Plasmazelle mIg Ig Carboxy-terminales Ende Membran- domäne Igb Iga

Umschaltung auf Ig-Sezernierung VH Cm1 Cm2 Cm3 Cm4 Mm1,2 DNA Poly(A)s Prä-mRNA Poly(A)m AAAA Cap AAAA Cap mRNA ms mm H-Kette Genetischer Mechanismus: Konkurrenz der Poly(A)-Reaktion und dem Spleißvorgang

IgH Class Switch Recombination (CSR) Molekulare Grundlage für die Erzeugung des Repertoires der biologischen Effektorfunktionen durch Austausch der konstanten Regionen der H-Kette unter Beibehaltung der Antigenbindungsstelle (nur bei Ig aber nicht bei TZR) VH Cm Cd Cg3 Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca IgM Sm Sg3 Sg1 Sg2b Sg2a Se Sa Cm Cg3 VH Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca Cd S, Schalter (switch)-Regionen Kontrolliert durch Zytokine IgG1 CSR AID VH Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca Genetischer Mechanismus: DNA-Looping-out und Deletion

(Antikörper generierend) T-Zell-abhängige und unabhängige Aktivierung The World of Antigens (Antikörper generierend) IgG, IgA, IgE B cells recognize everything Proteins Lipids Nucleic acids Carbohydrates Chemical molecules or haptens (half antigens) Even plastic But only proteins are good thymus-dependent antigens +/-TH IgM Plasma- zelle Ag IgD +TH Naive B-Zelle Gedächtnis- B-Zelle

Thymus-unabhängige (TI) Aktivierung Independent) (Thymus- Dependent) From Kuby Benötigt normalerweise keine T-Zellhilfe Lipopolysaccharide Antigene mit repetitiven Epitopen (e.g., Poly-saccharidee, Haptene gekoppelt an Poly-saccharide v.a. B1- und Marginal-Zonen-B-Zellen →Kein Gedächtnis Benötigt T-Zellhilfe Proteine mit monomeren Epitopen (e.g., Tetanus, Diptherie) Hapten gekoppelt an Proteinträger (e.g., Medikamente) v.a. follikuläre B-Zellen (B2) → Gedächtnis

Thymus-abhängige B-Zellaktivierung Lymphknoten CD4-T CD8-T MHC II MHC I DZ TK T-Zellzone Dendritische Zelle (DZ) Plasmazelle Gedächtnis-B B-Zellzone TH B Infektion

Periphäre lymphatische Organe Afferentes lymphatische Gefäß Paracortex (T-Zell-Zone) B-Zell- Zone Mark Arterie Sekundärer B-Folikel „Keimzentrum“ Primärer Follikel (B-Zellen) Efferentes lymphatisches Vene Lymph- knoten Appendix Milz Tonsilen Peyer'sche Plaques

Follikel mit Keimzentrum Überblick: T-Zell-vermittelte B-Zellaktivierung Antigen (Antikörper generierend) Expansion Differenzierung IgM (Extrafollikuläre T-Zell-Zone Reaktion) +/- TH +/-TH Kurzlebige Plasmazelle (IgM) Reife B-Zelle +TH B-Zell- Klon Keimzentrums- reaktionen Gedächtnis IgH-Klassen- wechsel Selektion Somatische Hypermutation Proliferation Gedächtnis- B-Zelle (IgG, IgA, IgE) Sekundär- Follikel mit Keimzentrum B-Zell-Zone (follikuläre Reaktion) Langlebige Plasmazelle (IgG, IgA, IgE) Primär- follikel Lymph- knoten

Extrafollikuläre Phase der B-Zellaktivierung B-Zell-Epitop (Peptid oder Hapten) Träger T-Zell-Epitop (Peptid) Gekopplte Erkennung (Linked recognition) B- und T-Zellepitop müssen auf dem gleichen Molekül liegen Träger IL2/4/5 ILR CD40 CD40L-Defizienz Keine Antwort gegen Proteine (z.B. Tetanus) Kein Klassenwechsel Kein Gedächtnis → Keine Schutzimpfung Aber gute Antwort gegen Kohlenhydrate !!!! → Viel IgM im Serum → Hyper-IgM-Syndrom I 1 BZR CD40L 2 MHC II + Peptid TZR TH + B Immunologische Synapse

Signaling Complex and intracellular signaling pathways BZR-Signaltransduktion Signal Transducer and ITAM Motifs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif) Signaling Complex and intracellular signaling pathways BCR IgαIgβ Signalosome BCR Igα/Igβ X-X-Tyr-X-X-Tyr-x ITAM P docking of signaling proteins

BZR-Korezeptoren erniedrigen die Aktivierungsschwelle Bedeutung des Korezeptors für Ag-abhängige B-Zellaktivierung Ohne Beteiligung des Korezeptors sind 104 mIgM-Moleküle notwendig, mit Beteiligung des Ko-Rezeptors jedoch nur ca. 102 mIgM-Moleküle Immunisierung mit Fusionsprotein besteh-end aus Antigen und C3d induziert 1000-fach höheren Antikörpertiter als Antigen alleine POSITIVES SIGNAL Aus Abbas: Cellular and Molecular Immunology ITAM ITAM Beteiligung des Korezeptors erniedrigt die für die B-Zellaktivierung benötige Antigendosis

Cross-talk zwischen BZR und FcR (negatives Signal) ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif) I/L/V x pY x x I/V/L BCR SHP src homology containing phosphatase Rekrutierung Aus Abbas: Cellular and Molecular Immunology ITAM Igαβ Terminierung der B-Zellaktivierung bei Überschuss löslicher Ag-spezifischer Antikörper

Follicular reaction (in germinal center) Apical light zone IgH class switch Memory B Plasma blasts Memory B Plasmablast Long-lived plasma cells in bone marrow Selected centrocyte Basal light zone Selection of high-affine centrocytes by binding to Ag-Ab complexes on FDC Follicular dendritic cell (FDC) Ag-Ab complexes Centrocyte B T Tingible-body macrophage Janeway Dark zone Somatic mutation of VH / VL regions Kuby Centroblast (activate B cell)

Somatische Punktmutationen in V-Region Mutations-Stammbaum AID Somatische Punktmutationen Punktmutationen sind willkürlich über das gesamte V-Exon des L- und H-Ketten gens verteilt (keine Hotspots !!!!) Aus Janeway

AID, a critical component of the Ig hypermutator AID = Activation-Induced Deamidase Only expressed in activated germinal center (GC) B cells (cDNA was cloned from IL-activated B cell line) Converts C to U (oxydative deamination) Homology to RNA editing enzyme APOBEC AID knock-out mice and AID-def. patients no somatic hypermutation (SHM) no IgH class switch recombination (CSR) no memory B cells But antibodies againts proteins (only IgM!!!!) → Hyper-IgM-Syndrome Type II AGCT TCGA AID AGCT TUGA AID Cytosin Uracil Uracil-N- glycosidase (UNG) AGCT T GA Modifier (??) fills gap with any base SHM

AID is essential for IgH Class Switch Recombination (CSR) VH Cm Cd Cg3 Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca Sm Sg3 Sg1 Sg2b Sg2a Se Sa IgM Cm Cg3 VH Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca Cd IgG1 CSR AID VH Cg1 Cg2b Cg2a Ce Ca Molekulare Grundlage für die Erzeugung der Repertoires der biologischen Effektorfunktionen durch Austausch der konstanten Regionen der H-Kette unter Beibehaltung der Antigenbindungsstelle (nur bei Ig aber nicht bei TZR)

Mutations cluster in paratop (Ag binding sites) Somatic Hypermutation (SHM) Distribution of mutations before and after selection by Ag-Ab complexes on FDC Mutations cluster in paratop (Ag binding sites) VH residue AID Mutated GC centrocystes before selection bind immunogen not at all with lower affinity with the same affinity with the same affinityt with higher affinity bind different antigen react with self-antigen produce no BCR (nonsense Mutation) Mutationsrate von IgV = 10-5 bp/Generationszeit Natürliche Mutationsrate = 10-12 bp/Generationszeit Selection Somatic hypermutation

Somatische Hypermutation (SHM) Mutationsverteilungen Konsequenz der Hypermutation B-Zellen binden ursprüngliches Antigen gar nicht schlechter mit derselben Affinität besser Binden anderes Antigen Binden Selbstantigen Produzieren keinen Ig-Rezeptor (nonsense Mutation) Mutationsrate von IgV = 10-5 bp/Generationszeit Natürliche Mutationsrate = 10-12 bp/Generationszeit Somatische Hypermutation (SHM) Selektion

Selektion von B-Zellen mit hoch-affinen BZRs Apical light zone IgH class switch Memory B Plasma blasts Memory B Plasmablast Long-lived plasma cells in bone marrow Selected centrocyte Basal light zone Selection of high-affine centrocytes by binding to Ag-Ab complexes on FDC Follicular dendritic cell (FDC) Ag-Ab complexes Centrocyte B T Tingible-body macrophage Janeway Dark zone Somatic mutation of VH / VL regions Kuby Centroblast (activate B cell)

B-Zellen erkennen Antigen auf FDZ Selektion von B-Zellen mit hoch-affinen BZR B-Zellen erkennen Antigen auf FDZ aus Abbas

Mutationscluster in Paratop (Ag-Bindestellen) Ergebnis der Selektion  Affinitätsreifung B-Lymphozyten behalten Spezifität, besitzen aber einen BZR mit einer höherer Affinität zu dem für die Immunisierung verwendeten Antigen (Affinitätsreifung) Mutationscluster in Paratop (Ag-Bindestellen) Tetanus k=106 M-1 Tetanus k=108M -1 Naiv Gedächtnis Mutationen vor Selektion sind über gesamte V-Region verteilt Mutationen nach Selektion clustern in CDRs ‚Nebenprodukt‘: Autoreaktive B-Zellen, die ein Selbst-Antigen auf FDZ erkannt haben

Selektion von B-Zellen mit hoch-affinen BZRs Apical light zone IgH class switch Memory B Plasma blasts Memory B Plasmablast Long-lived plasma cells in bone marrow Selected centrocyte Basal light zone Selection of high-affine centrocytes by binding to Ag-Ab complexes on FDC Follicular dendritic cell (FDC) Ag-Ab complexes Centrocyte B T Tingible-body macrophage Janeway Dark zone Eliminierung autoreaktiver B-Zellen, die, wenn an FDZ gebunden, auch positiv selektioniert werden können Somatic mutation of VH / VL regions Kuby Centroblast (activate B cell)

Secondary, long-lived plasma cell Selektion und Differenzierung Secondary, long-lived plasma cell IgM, IgA, IgG, IgE Memory B cell IgG, E, A IL2/4/5 Antigen ILR CD40 BZR CD40L B + Peptid Keimzentrum B-Zelle TH MHC II TZR Ag-spezifische TH-Zelle Aus Janeway Quellen für Antigen: FDZ-gebundenes Antigen Iccosomen – Immuncomplex-coated bodies (werden von der FDZ abgegeben. Diese binden dann an B-Zellrezeptor)

Terminal plasma differentiation Requirement for BLIMP-1 (B lymphocyte induced maturation protein 1) and XBP-1 (X-box binding protein), two transcriptional suppressors/repressors Transfection of Blimp1 gene into lines and primary B cells Calame and coworkes Davis and coworkers Blimp1 + B cell Knock-out mouse (RAG complementation Approach) XBP-1 -/- Glimcher and coworkes

Primary and Seconday Antibody Response Primary Response Naive B Predominantly IgM but also other classes Lag 7-10d Peak 4-7d Thmyus-dependent & -independent Ag Low affinity (~ 10-7 1/M) Secondary Response Memory B IgG and others Lag 1-3d Peak 3-5d Thymus-dependent Ag Higher affinity (10-10 1/M) Higher titers (100 – 1000x) Aus Kuby

Modified secondary repertoire Zusammenfassung: Humorale Immunität B Cell Maturation (BM) Memory B cell Germinal Center SHM CSR Memory B Plasma Plasma cell +TH IgG IgA IgE Modified secondary repertoire V repertoire - increased affinity CH repertoire - effector functions Antigen-induced B Cell activation (Periphery) Ag Primary repertoire V repertoire - specificity