Assoziationen in dicht gepackter Umgebung und Excluded Volume Effekt 22.06.2004 Ina Meiser

Gliederung Einleitung Was ist excluded volume? Modell für makromolekulare dicht gepackte Umgebungen Beobachten von makromolekularen Reaktionen in dicht gepackter Umgebung Effekte von dicht gepackten Umgebungen auf Proteinfaltung Ausblicke

Crowded Environment (dicht gepackte Umgebung) Zellen enthalten viele Makromoleküle die einen Großteil des Gesamtvolumens besetzen (10-40%), sie sind also dicht gepackt crowded media oder auch: volume-occupied media crowded ≠ konzentriert

Probleme bei Experimenten in vivo: bis zu einigen hundert g/l von verschiedenen Makromolekülen in einem biologischen Medium in vitro: Medien stark verdünnt, selten ist die Konzentration höher als 1g/l und weniger Makromoleküle insgesamt → Crowding kann durch Zufügen von synthetischen oder natürlichen Molekülen nachgeahmt werden (genannt: crowders oder crowding agents)

Excluded Volume (ausgeschlossenes Volumen) Grundlegendes Prinzip: Gegenseitige Undurchdringlichkeit von Molekülen → nur sterische Abstoßung als fundamentale Wechselwirkung Anschaulich: Bechermodell

Excluded Volume: Konsequenzen Für kleine T: Erreichbares Volumen ist fast gleich dem unbesetzten Für große T: erreichbares Volumen wird kleiner, Beitrag der räuml. Abstoßung zur reduzierten Entropie und steigenden freien Energie wird entsprechend größer

Excluded Volume: Entropische Konsequenzen Minimierung des ausgeschlossenen Volumens bedeutet Reduzierung der freien Energie → Konsequenz von Crowding: Erleichterung von Prozessen die zu einer Abnahme des excluded volume führen Crowding wird die Assoziation von Molekülen erleichtern die schon die Tendenz haben sich zusammenzulagern, es wird diese Tendenz aber nicht de novo erzeugen

Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen des excluded volume effects D.Hall, A. Minton: Einfaches Modell mit starren globulären Proteinen die nur durch räumliche Abstoßung miteinander interagieren → Experimentell gemesse Aktivitätskoeffizienten können erstaunlich korrekt geschätzt werden konnten

Thermodyn. Modell für Vorhersage von Einflüssen des excluded volume effects Allgem. Reaktionsgleichung r = stöchiometrischer Koeffizient des Eduktes R p =stöchiometrischer Koeffizient des Produktes P ‚nicht idealer Faktor‘ , ein zusammensetzungsabhängiges Maß für Interaktionen von gelösten Stoffen Thermodynamischer Aktivitätskoeffizient

Anwendung des Modells Gelöstes globuläres Protein T dessen Aktivitätskoeffizient bestimmt werden soll Ein zweites globuläres Protein C als crowder, das einen Teil Ф des Gesamtvolumens besetzt →Starkes Ansteigen der Aktivitätskoeffizienten bei zunehmendem ausgeschlossenen Volumen

Beispiel: Einfache Isomerisationsreaktion Reactant ↔ Product Jede Konformationsänderung die das effektive Volumen des gelösten Stoffes erhöht (z.B. Proteinentfaltung) wird schrittweise mit Zunahme des crowding inhibiert

Beispiel: Reaktion von n Monomeren zum n-Mer n Reactants ↔ Product Zusammenlagerung wird mit zunehmendem crowding erleichtert Ausmaß des crowding Effekts wächst mit zunehmendem Grad der Zusammenlagerung

Zusammenfassung der Effekte auf Reaktionen in crowded media

Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen (I) Solvent wird als Kontinuum angenommen → effektives Interaktionspotential zwischen gelösten Stoffen ist unempfindlich gegenüber der molekularen Natur des Solvents Einfluss von ‘soften‘ Interaktionen → können durch Vergrößerung der Partikelradien in das Modell eingebaut werden Nicht-Additivität von soften Interaktionen → z.B. elektostatische Abstoßung Modell gibt keine realistische Beschreibung der Interaktionen

Grenzen des Modells und mögliche Verbesserungen (II) Einfluss von strukturellen Details → brauchbare Schätzungen von excluded volume benötigen eine gute Auflösung von Größe und Form der interagierenden Partikel

Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in crowded media? (I) Fluoreszenzbasierte Methoden → messen die Abnahme der brownschen Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Protein, wenn es mit anderen Proteinen assoziiert FRET (Fluorescence resonace energy transfer) →spürt durch crowding eingeleitete Konformations-änderungen auf FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) →misst die Verteilungsbewegung von fluoreszenzmarkierten Molekülen

Wie beobachtet man makromolekulare Reaktionen in crowded media? (II) NMR (Nuclear Magnetic Resonance) → Charakterisieren makromolekulare Bewegungen und Konformationen in crowded media in lebenden Zellen Cryoelektronenmikroskopie →Sichtbarmachen des Zellinneren und Aufspüren von komplexen makromolekularen Zusammenlagerungen

Effekte von Crowding auf Proteinfaltung an einem Beispiel A. Elcock (Iowa,USA) simulierte die ‘Flucht‘ von einem Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig (Chaperon) Experimentelle Durchführung von Martin und Hartl (Tübingen) → hohe crowder Konzentration zwingt die Faltungszyklen in dem gleichen GroEL-Käfig abzulaufen

GroEL/GroES Aufbau 2 heptamere Ringe die einen Zylinder bilden (GroEL) Heptamere Kappe die sich anlagert und den Innenraum vergrößert (GroES) Lewin, Molekularbiologie der Gene

GroEl/GroES Mechanismus Schrittweiser Prozess Mit jedem Schritt geht ATP-Hydrolyse einher GroES für Freisetzung des Proteins Protein wird nach jedem Faltungszyklus freigesetzt und wieder eingefangen Lewin, Molekularbiologie der Gene

Methoden Brownsche Dynamiksimulation Das Profil der freien Energie wird berechnet, wenn ein Rhodanese-Molekül aus dem GroEL-Käfig in Umgebungen mit verschiedenen Crowder-Konzentrationen entlassen wird Rhodanesestruktur aus PDB

Methoden bezüglich der Molekülstrukturen GroES aus den Simulationen ausgelassen Rhodanese-Struktur: Kristallstruktur des komplett gefalteten Proteins, weil die Simulationsmethode keine interne Flexibilität abdeckt → Ergebnisse werden höchstens unterschätzt Keine detaillierte Struktur für den crowder Ficoll 70 →modelliert als kugelförmiges Molekül (Radius: 30Å), alle Moleküle sind gleich

Methoden Interaktionen zwischen den Oberflächenatomen von Ficoll 70, GroEL und Rhodanese werden durch das Lennard-Jones-Potential modelliert Jedes hinzugefügte crowder-Molekül wird zunächst an 10 zufällig gewählten Positionen platziert. Die Position mit der günstigsten Energie wird genommen Verteilungskoeffizienten abhängig vom Molekulargewicht wählen Bewegung der crowder simuliert durch den Ermak -McCammon - Algorithmus

Berechnung von ∆G Rhodanese wird in 0.5 Å Schritten von der Ausgangsposition im Käfig zu der Endposition (150 Å entfernt vom Käfigzentrum) bewegt Änderung der freien Energie berechnet durch: ∆E = Differenz der Systemenergien, wenn sich Rhodanese an den Positionen x und x+0.5 Å befindet

Ergebnisse (I) Je größer die Konzentration an crowder-Molekülen, desto größer wird die zum Entfernen von Rhodanese benötigte Energie →größere Konzentration an crowdern macht die ‘Flucht‘ von Rhodanese unwahrscheinlicher

Ergebnisse (II) Je größer die Konzentration an crowdern desto größer ist der Betrag an komplett gefalteten Rhodanesemolekülen Experimentelle und berechnete Daten stimmen sehr gut überein

Ergebnisse (III) Crowder durch Ladungs-patches modifiziert → benötigte freie Energie erhöht sich beträchtlich, allerdings erst bei sehr hohen crowder-Konzentrationen ∆∆G‡ = freie Energie bei Anwesenheit der crowder minus freie Energie bei Abwesenheit der crowder

Analogie zum Hydrophoben Effekt Wenn crowder-Moleküle am liebsten miteinander interagieren: → Störungen der crowder-crowder Interaktionen werden begrenzt →Dissoziation der gelösten Proteine wird verhindert Eisberg Modell, Kauzberg 1959

Ausblicke Makromoleküle die die günstigsten Wechselwirkungen mit sich selbst eingehen als effektive crowder, die schwache Protein-Protein-WW stabilisieren → muss über excluded volume effect hinaus gehen

Zusammenfassung der Effekte von Crowding: Vergrößert die Reaktivität von Makromolekülen Proteinfaltung wird unterstützt Beeinflusst biochemische, biophysische und physiologische Prozesse Bsp.:  Nukleinsäure und Proteinkonformation  Protein-Protein- und Protein-DNA- Assoziationsgleichgewichte und Kinetik  katalytische Aktivität von Enzymen  Regulation des Zellvolumens

Referenzen Rivas, G., Ferrone, F., and Herzfeld, J., (2004) EMBO Reports, 5, 23-27. Life in an Crowded World: Workshop on the Biological Implications of Macromolecular Crowding. Hall, D. and Minton, A.P., (2003), Biochim. Biophys. Acta, 1649, 127-139. Macromolecular Crowding: Qualitative and Semi-Quantitative Successes, Quantitative Challenges. Elcock, A.H., (2003) Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 2340-2344. Atomic-Level Observation of Macromolecular Crowding Effects: Escape of a Protein from the GroEL Cage.