Experimentelle Methoden zur Bestimmung von Protein-Protein Wechselwirkungen Presented by Stefan Nickels (stefan-nickels@arcor.de) Proseminar: Theoretical Analysis of Protein-Protein Interactions SS04

Übersicht Einführung 3 Arten von experimentellen Methoden Physikalische Methoden Library basierte Methoden Genetische Methoden 3 ausgewählte experimentelle Methoden FRET NMR chemical shifts NMR-based protein docking Referenzen Diskussion

Was will man bestimmen? Auffinden von Proteinen, welche mit anderen wechselwirken durch meist transiente aber auch persistente Bindung Bindungskonstante Ki Thermodynamische Gleichgewichtsgröße Gibt an welcher Anteil des Liganden im Mittel an Protein gebunden Je kleiner Ki desto stärker Protein-Ligand Bindung Freie Bindungsenthalpie ∆G

Physikalische Methoden I Methodik Bestimmung von Wechselwirkungen unter Zuhilfenahme von physiko-chemischen Eigenschaften der Wechselwirkungspartner Beispiele Protein Affinity Chromatography Affinity Blotting Imunnoprecipitation Cross-Linking

Physikalische Methoden II Affinitätschromatographie Um bindende Liganden zu finden Immobilisierung des Proteins in der Säule auf einer Matrix z.B. mittels GST Fusionsproteine Proteine werden mit Gluthation S-Transferase markiert Dieses bindet an Gluthation-Agarose-Matrix Zugabe des Ligandengemischs Bindende werden zurückgehalten, nicht bindende fließen durch Komplexe können ausgewaschen werden

Library basierte Methoden I Methodik Suche nach Bindungspartnern für gewisses Protein in Gen-Expressions-Bibliotheken Vorteile Schnelles Screening einer große Menge von möglichen Liganden Gensequenzen der Bindungspartner sind sofort verfügbar Nachteil Müssen i.d.R. mit Biochemischen Methoden verifiziert werden Beispiele Protein Probing Phage Display Two-Hybrid Sytem

Library basierte Methoden II Two Hybrid System Modularer Aufbau von Transkriptionsfaktoren DNA-binding domain Activation domain Nicht kovalente WW hinreichend für Funktion Erstellen von sog. Hybriden Protein X + DNA-binding domain Protein Y + Activation domain Wechselwirkung von X und Y Domänen bilden funktionellen Aktivator für Reportergen => Expression Screening von Activator domain markierten Transkripten einer cDNA-Library

Genetische Methoden I Methodik Beispiele Nicht WW zwischen Proteinen werden bestimmt Sondern WW zwischen Genen werden betrachtet In vielen Fällen interagieren dann auch die Genprodukte Oder Suche nach Gen-Gen-WW um Protein-Protein-WW zu bestätigen Beispiele Extragenic Suppressors Synthetic Lethal Effects Overproduction Phenotypes Unlinked Noncomplementation

Genetische Methoden II Extragenic Suppressors Suppressormutationen gleichen durch natürliche Mutationen hervorgerufene phenotypische Defekte aus Beobachtung: Suppressormutationen treten bei Genen auf, deren Genprodukte mit Genprodukten der mutierten Gene wechselwirken Aufspürung wegen Suppressormutationen interagierenden Genprodukten durch z.B.: Kontrolle der Zellzyklen

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy I Zielsetzung Beobachtung von Protein-Protein WW bei Abständen > 100 Å Betrachtung von Proteinen in Zellen in vivo Proteine müssen mit Flurophoren gelabelt werden FRET “molecular ruler” Bestimmung von Distanzen zwischen Molekülen Viele verschiedene FRET-Methoden Hier:Bestimmung der Interaktion von kolokalisierten Proteinen im lichtmikroskopisch detektierbaren Bereich Detektion Normalerweise spektroskopisch Hier lichtmikroskopisch

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy II Funktionsprinzip Man macht sich den Effekt des Energie Transfers zwischen zwei bestimmten benachbarten Fluorophorpaaren zu nutzen Wird ein Fluorophor (Donor) durch Licht bestimmter Wellenlänge angeregt, so fluoresziert er In gewissem Abstand zu einem sog. Akzeptor-Fluorophor, überträgt der Donor Energie (Photon) auf diesen Akzeptor Durch den Transfer Unterbindung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors, stattdessen Fluoreszenz des Akzeptors (Quenching) Mittels Fluoreszenz-Mikroskopischen Aufnahmen kann die Löschung der Fluoreszenz-Resonanz des Donors dokumentiert werden

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy III Die Effizienz dieses Enegie-Transfers ist abhängig von der Distanz r der beiden Fluorophore R0 ist der sog. Förster-Radius spezifisch für jedes Donor-Akzeptor-Paar, i.d.R. zwischen 10 und 70 Å Maß für den Grad der Überlappung von Donoremission und Akzeptoranregungsspektrum kein FRET bei Abständen > 2R0 Quantifizierung der Transfer-Effizienz über das Ausmaß der Donor-Emissions-Löschung IDA = Intensität der Donor Fluoreszenz in Anwesenheit des Akzeptors IDA†= Intensität der D. Fluoreszenz in Anwesenheit von photogebleichtem A.

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy IV Experiment Untersuchung von WW zwischen Proteinen in der Plasmamembran Fluorophor-Paar Labeling entweder direkt oder mittels Immun-Fluoreszenz-Markierung Hier Transfektion von Kaninchen-Nieren-Zellen mit der 5‘-Nucleotidase aus der Leber von Ratten Markierung der Nucleotidasen mit einer Mischung aus Cy3 / Cy5 markierten IgG-AntiKörpern R0 = 53 Å Donor Cy3 Akzeptor Cy5 Absorptionsmaximum 550 nm 650 nm Emissionsmaximum 570 nm 670 nm

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy V Aufnahme von 4 Bildern Cy3-Emission vor dem Bleichen Auftreten des FRET Wenig Donor Fluoreszenz Cy5-Emission vor dem Bleichen Zur Überprüfung, ob Kolokalisierung mit Cy3 stattgefunden hat Cy3-Emission nach dem Bleichen Kein FRET mehr Donor Fluoreszenz ist stärker (Pfeile) Cy5-Emission nach dem Bleichen Keine Emission wegen vollständiger Ausbleichung Datenanalyse Nach Hintergrund-Korrektur mittels Aufnahme von unmarkierten Zellen: Berechnung eines Transfer-Effizienz-Bildes a= Scaling Factor für die Umrechnung der Pixelwerte in Effizienzwerte

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Microscopy VI Auswertung Im Beispiel Effizienz-Werte zwischen 0 und 40% lassen hier nicht auf spezifische WW zwischen den Nucleotidasen schliessen Effizienz hängt ab von der Oberflächendichte der Proteine in der Membran (Zufällige Nähe) Fazit Transfer Effizienz reflektiert nicht unbedingt eine spezifische WW E abhängig von vielen Parametern: Größe des gelabelten Proteins Sättigung des Antigens mit Antikörper Orientierung der Fluorophore Durch systematische Veränderung von experimentellen Parametern können spezifische WW unterschieden werden Verhältnis von Donor- zu Akzeptor-Markierung Gesamtkonzentration von markierten Molekülen

NMR chemical shift mapping I Zielsetzung Bestimmung von Wechselwirkungen und Interaktionsstellen zwischen Proteinen mittels zweidimensionaler (1H, 15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie Grundlagen der H-NMR Spektroskopie Im Magnetfeld: Parallele Ausrichtung von Protonenkernen Erhöhung der Feldstärke => Umorientierung der Kerne, antiparallel zum Magnetfeld Hierbei Resonanzphänomen: Absorption von Energie => NMR-Signal Identifizierung aller Protonen in einem Molekül oder ein Komplex aus Molekülen

NMR chemical shift mapping II Die chemische Verschiebung Abschirmung Elektronen um den Kern erzeugen Magnetfeld, entgegengesetzt zum äußern Magnetfeld => Abschirmungseffekt Höhere Magnetfeldstärke benötigt um Abschirmung zu umgehen Signal im niedrigeren Frequenzbereich => diamagnetisch Entschirmung z.B. durch elektronegative Bindungspartner (Halogene, O, N) diese ziehen die Elektronen zu sich Niedrigere Feldstärke benötigt Signal im höheren Frequenzbereich => paramagnetisch Signalverschiebung relativ zu Referenzsignal TMS (Tetramethylsilan) Alle Protonen in TMS gleiche chem. Umgebung => nur ein Signal Alle Protonen maximal abgeschirmt

NMR chemical shift mapping III Die J-Kopplung Spin-Spin Kopplung Benachbarte Protonen beeinflussen sich gegenseitig bzgl. lokaler Magnetfeldstärke Je nach Spinrichtung eines benachbarten Protons, ↑ oder ↓ => Schwächung oder Verstärkung des äußeren Magnetfelds Da beide Zustände gleichwahrscheinlich => Aufspaltung des Signals in Multipletts 1 benachbartes Proton => 2 Signale 2 benachbarte Protonen => 3 Signale mit unterschiedlichen Intensitäten usw. Kopplungskonstante J Abstand zwischen gekoppelten Signalen in Hz: Kopplungskonstante J Je nach Wert: Abschätzung wie viele Bindungen voneinander entfernt 2 Bindungen, geminal, 2J 3 Bindungen, vicinal, 3J

NMR chemical shift mapping IV (1H, 15N)-HSQC-NMR-Spektroskopie HSQC = Heteronuclear single quantum coherence 2D-NMR x-Achse: Verschiebung von H y-Achse: Verschiebung von N Heteronuclear Single quantum: Bestimmung der 1J Kopplung zwischen H und N => direkt verbundene Atome Kreuzpunkte: Kopplung von H und N Untersuchung von Proteinen Jede Aminosäure außer Prolin: Kopplungssignal der Amidgruppe Ebenso AS-Ketten wegen Peptidbindung WW zwischen Proteinen Bindung von Ligand an 15N markiertes Protein => Änderung der chem. Verschiebungen Möglichkeit der Identifizierung der ww. AS bei zugewiesenem Spektrum

NMR chemical shift mapping VI Experiment Bacterial phosphoenolpyruvate sugar transport system (PTS) Teilreaktion: Übertragung von Phosphor Bekannt: Spezifisch für verschiedene Spezies Betrachtung von B. subtilis und E. coli große Ähnlichkeit in 3D Struktur Homologe WW stark: bsHPR + bsEIIAglc ecHPR + ecEIIAglc Heterologe WW stark: ecHPR + bsEIIAglc schwach: bsHPR + ecEIIAglc Fragestellung: Kann „NMR chemical shift mapping“ Spezifität der Reaktionen widerspiegeln?

NMR chemical shift mapping VII Versuchsdurchführung Untersuchung von nicht phosphorylierten Proteinen um Mögliche Rückreaktion auszuschließen Phosphohydrolysis auszuschließen Phosphorylierung hat keine relevanten Auswirkungen auf WW 4 NMR-Experimente NMR-Spektren von 15N-HPR vor (blau) und nach Zugabe (rot) von unmarkiertem EIIAglc A: ecHPR + ecEIIAglc B: bsHPR + bsEIIAglc C: ecHPR + bsEIIAglc D: bsHPR + ecEIIAglc

NMR chemical shift mapping VIII Auswertung Keine Verschiebung bei bsHPR + ecEIIAglc (D) => Überlagerung der Kreuzpunkte => keine WW Durch Zuordnung der Spektren => Identifizierung von ähnlichen Bindungstellen (schwarz) Fazit Methode geeignet um spezifische WW zu detektieren Trotz hoher Konzentrationen (>200 μm) von gereinigtem Protein bei NMR-Experimenten, keine Verunreinigung der Spektren durch unspezifische WW

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm I Idee Protein-Protein Docking Problem Gegeben 3D Struktur von komplexbildenden Proteinen A u. B Ermittle 3D-Struktur des Komplexes AB Abwandlung: zusätzlich unzugewiesenes experimentelles 1D 1H-NMR-Spektrum als Input Verwendung des Rigid Body Docking Algortihmus von Lenhof (1995,1997) Generiert Liste möglicher Komplexe Bewertung mittels geometrisch energetischer Scoring-Funktion Ziel Bewertung der Komplexe mittels Neuer Scoring-Funktion, die Daten des experimentellen H-NMR-Spektrums miteinbezieht

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm II Neue Scoring Funktion Berechnet theoretisches H-NMR-Spektrum für jeden möglichen Komplex Abweichung des simulierten Spektrums vom experimentellen Spektrum => Bewertung der Komplexe Berechnung der Chemischen Verschiebung des Komplexes Zerlegt Chemische Verschiebung δ in 4 Teile: δRC: Random Coil shift δA: Magnetic Anisotropy δJB: Ring current, Ringstromeffekt δEF: Electric field effect

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm III δJB - Electric field effect Einfache chemische Verschiebung aufgrund von umgebenden Elektronen Spezifisch für jede Bindung, C-H, N-H Konstante ε übernommen von Williamson und Asakura(1993) Elektrisches Feld berechnet mittels Gesetz von Coulomb Atomladungen aus dem AMBER 94 Kraftfeld (Connell et al. 1995) δRC – Random coil shifts Verschiebungen von nicht definiert gefalteten As-Ketten Übernommen aus der BRMB Datenbank

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IV δA – Magnetische Anisotropie der Peptidbindung Anisotropieeffekt: Doppelbindungen C=O hat nicht in alle Richtungen die gleiche Elektronenverteilung Oberhalb der Bindungsebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Modelliert nach McConnell (1957) mittels Suszeptibilitäts-Tensor (Matrix) Kennzeichnet Orientierung eines Protons zur anisotropen Bindung R: Abstand Proton-Anistropische Bindung Na: Avogadrosche Zahl θi: Winkel zwischen i-Achse und Distanz-Vektor R Χi: Suszeptibilitätstensor für Carbonylgruppe der Peptidbindung

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm V δJB – Ringstromeffekt Ebenfalls Anisotropieeffekt: Aromatische Ringsysteme verursachen ungleiche Elektronenverteilung durch π-Elektronen-System Oberhalb der Ringebene stärker abgeschirmt als in der Ebene Äußeres Magnetfeld erzeugt Ringstrom im Aromaten Erzeugt seinerseits entgegen gesetztes Magnetfeld Modelliert nach Johnson and Bovey (1958): n = Anzahl der π-Elektronen e0, m = elektrische Ladung und Masse e = Lichtgeschwindigkeit a = Ring Radius (5-Ring 1,182Å ; 6-Ring 1,39Å) p, z = geben die Position des Kerns relativ zum Ring-Zentrum wieder K,E = komplett elliptische Integrale

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VI Bestimmung eines theoretischen NMR-Spektrums Simulation mittels Lorentzschen Linien Gesamtspektrum = Linearkombination der Lorentzlinien W = Linienbreite ( 0.0032 ppm2 ) Pi = Peakposition Entfernung der Peaks für austauschbare Protonen (OH, NH), nicht in wässriger Lösung vorhanden Bestimmung der Differenz zwischen experimentellem (Sexp) und simuliertem Spektrum (Sepx) an 5000 verteilten Positionen xi im Bereich (-2 bis +12 ppm) Normalisierte Werte werden zum Bewerten der Strukturen verwendet

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VII Ziele der Integration von NMR-Daten in RBD-Algorithmen Erhöhung der Zuverlässigkeit der RBD-Algorithmen durch neue Scoring-Funktion Beschleunigung der Strukturaufklärung durch simulierte Verschiebungszuweisungen basierend auf Docking-Resultaten Evaluierung 4 Komplexe Calmodulin + Ca2+ abhängige Proteinkinase Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein Homodimere Untereinheiten von S100B(ββ) Einzelstrukturen aus PDB Generierung der exp. NMR-Spektren aus Shiftzuweisungen der BRMB-Datenbank

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm VIII Auswertung Auftragung der möglichen Komplexe x-Achse: RMSD y-Achse: Atom-Kontakt Energie Beste Ergebnisse linke untere Ecke Beste Ergebnisse ohne Anisotropieshift => herausgenommen, lokaler Effekt S100 dimer Cal + Pump S100 + p53 Cal + Kinase

Structure prediction of protein-complexes by an NMR-based protein docking algorithm IX Auswertung Calmodulin + Ca2+ abhängige Proteinkinase Sehr gutes Ergebnis Calmodulin + Bindungspeptid der Ca2+ Pumpe Gutes Ergebnis Allerdings falsche Struktur auf Platz 1 Grund unbekannt S100B(ββ) + Peptid aus P53 Protein verwunderlich, da mit herkömmlichen Scoring-Funktion nicht zu docken Untereinheiten von S100B(ββ) Gute Trennung zwischen zwischen True und False Positives Fazit Evaluation mit mehr Strukturen benötigt Weiterer Schritt Voraussage von Komplexstrukturen ohne NMR-Spektrum Geplant: Integration von mehrdimensionalen NMR-Spektren, welche mehr strukturelle Informationen enthalten S100 + p53

Fazit Experimentelle Methoden oft sehr spezifisch Nachteile: Ausblick: dienen zur Verifikation von theoretischen Erkenntnissen unabdingbar bei der Evaluation von bioinformatischen Methoden Nachteile: Erfordern hohes Fachwissen Fehleranfällig Stark abhängig von experimentellen Bedingungen Zeit- und Kostenintensiv Ausblick: Kombination von experimentellen Daten und bioinformatischen Methoden bringt Vorteil

Referenzen Phizicky, E.M. and Fields, S., (1995) Microbiol. Rev., 59, 94-123. Protein-Protein Interactions: Methods for Detection and Analysis. Kenworthy, A.K., (2001) Methods, 24, 289-296. Imaging Protein-Protein Interactions Using Fluorescence Resonance Energy Transfer Microscopy. Rajagopal, P., Waygood, E.B., Reizer, J., Saier-Jr., M.H., and Klevit, R.E., (1997) Protein Science, 6, 2624-2627. Demonstration of Protein-Protein Interaction Specificity by NMR Chemical Shift Mapping. Kohlbacher, O., Burchardt, A., Moll, A., Hildebrandt, A., Bayer, P., and Lenhof, H.-P., (2001) J. Biol. NMR, 20, 15-21. Structure Prediction of Protein Complexes by a NMR-based Protein Docking Algorithm.

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