Einzelmolekülspektroskopie an lebenden Zellen Vortrag für das physikalische Hauptseminar von Ulrich Stopper, Januar 2004

Vorteile der Untersuchung einzelner Moleküle: Quantitativer Einblick in biologische Prozesse Arbeit mit niedrigen Stoffkonzentrationen  natürliche Vorgänge in der Zelle werden nicht gestört Schwierigkeiten bei der Untersuchung einzelner Moleküle: empfindliche Detektoren hohe Zeitauflösung Photobleichen Photobleichen: Bei langer Laserbestrahlung, Übergang des Fluorophors in einen Zustand, der keine optische Relaxation erlaubt.

Drei Beispiele : 1.) Untersuchung der Endozytose 2.) Erforschung chemotaktischer Zellen 3.) Verfolgung der viralen Infektion

1.) Untersuchung endozytoser Prozesse in lebenden Zellen mit der Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Analyse (Bacia et al., MPI für biophysikalische Chemie in Göttingen, 2002)

1. Untersuchung der Endozytose Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS): Messung des Fluoreszenzsignals: 1. Untersuchung der Endozytose t F einzelne Fluorophore diffundieren durch den Laserfokus Anwendung der Autokorrelation (i = j) : τ GF 1  Diffusionszeit der Partikel : zeitliches Mittel τ : zeitliche Verschiebung Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie (FCCS): Messung zweier Fluoreszenzsignale, von spektral unterscheidbaren Molekülen. Anwendung der Kreuzkorrelation (i  j).  Anstieg von GijF(0), wenn zwei unterschiedliche Moleküle aneinander gebunden sind.

Experimenteller Aufbau für die FCCS: 1. Untersuchung der Endozytose Experimenteller Aufbau für die FCCS: Fokus Zellprobe lateraler 1/e²-Radius des Beobachtungsvolumens: ~0,18μm für grün, 0,25μm für rot Objektiv Laseranregung 488nm & 631nm (einige μW) Hauptstrahlteiler Fr Sekundärstrahlteiler Detektor 1 Detektor 2 Fg

1. Untersuchung der Endozytose Experiment : Bakterielles Cholera-Toxin (CTX) wurde mit Cy2- und Cy5- Farbstoffmolekülen an unterschiedlichen Untereinheiten des Moleküls markiert : Markiert mit Cy5: B5-Einheit (verantwortlich für die Bindung an die Zelloberfläche durch Wechselwirkung mit GM1-Gangliosid) Markiert mit Cy2: A-Einheit (enzymatisch aktiv) an eine Zellmembran gebundenes CTX

1. Untersuchung der Endozytose CTX nutzt vermutlich einen Pfad durch das Endoplasma und den Golgi-Apparat aus, den es rückwärts durchläuft, um zum endoplasmatischen Retikulum zu gelangen. Golgi-Apparat endoplasmat.Retikulum Aufnahme des Choleratoxins in die Zelle (Endozytose) Sekretproduktion durch das endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat (Exozytose)

1. Untersuchung der Endozytose Wie markiert man ein Biomolekül mit zwei verschiedenen Farbstoffen ? - Cy5 lagert sich ausschließlich an B-Einheit an. - Cy2-Färbung würde sich nicht nur an A-Einheit, sondern auch an B-Einheit binden  Experiment wäre nicht durchführbar Also: B-Einheit muss abgeschirmt werden  Einsatz von Antikörper gegen die B-Einheit - Einfärben der A-Einheit - Entfernen der Antikörper

1. Untersuchung der Endozytose Beobachtung des doppelt markierten CTX mit FCCS, gleichzeitig LSM-Imaging: - die ersten Sekunden: Keine Kreuzkorrelation (KK) und keine Autokorrelation (AK), LSM: Starkes Photobleichen  CTX ist unbeweglich  Anbindung an die Membran LSM-Bild der Zelle in den ersten Sekunden Pfeil: Photobleichen durch Korrelations-Messung - Kurz darauf: Nach anfänglichem Photobleichen, Anstieg von AK und KK  Erste Vesikel kapseln sich ab und diffundieren durch den Fokus Zellmembran und Membran-nahe Vesikel mit CTX

1. Untersuchung der Endozytose - 15 Min. später: Starke KK in den meisten intrazellulären Messungen  B- und A-Einheit sind immer noch an einander gebunden, diffundieren durch das Plasma LSM-Aufnahme des Zytoplasmas nach 15 Minuten AK Cy2 AK Cy5 KK gemessen an der markierten Stelle im linken Bild - einige Minuten danach: Abnahme der KK und der AK, LSM bestätigt Photobleichen  Immobilität  Vesikel werden vom Golgi-Apparat aufgenommen - Kurz darauf: leicht erhöhte AK, immernoch keine KK  A und B wieder beweglich, aber keine gemeinsame Bewegung LSM-Aufnahme des Golgi keine KK im Golgi A- und B-Einheit werden erst im Golgi von einander getrennt !

1. Untersuchung der Endozytose Diffusionszeiten im Zellplasma können aus Fits an die Korrelationskurven bestimmt werden: τDiff= 20ms  Diffusionskonstante D  6·10-9 cm2/s (langsame Diffusion) Stokes-Einstein-Gleichung: η  5 : Viskosität Rh : hydrodynamischer Radius  Durchmesser der diffundierenden Partikel: 2Rh  150nm  bestätigt Einschluß in Vesikel Weiterer Beweis für Vesikelbildung: Anwendung einer Mischung aus unterschiedlich einfach-markiertem CTX (CTX-Cy2 & CTX-Cy5) auf eine Zelle.  Starke KK im Zellplasma, obwohl jedes einzelne Molekül nur einfach markiert ist!  Mehrere CTX-Moleküle führen korrelierte Bewegungen aus.  Bindung in Vesikel AK- und KK-Kurven für unterschiedliche Mischungen

1. Untersuchung der Endozytose Zusammenfassung der Ergebnisse der Korrelations-Analyse von CTX: - FCCS kann verwendet werden, um herauszufinden, ob unterschiedliche Moleküle gebundene Bewegungen ausführen. - A- und B-Einheiten des CTX-Moleküls werden erst nach Erreichen des Golgi-Apparats voneinander getrennt. - Mehrere CTX-Moleküle werden in einzelne Vesikel zusammengeschlossen, die im Plasma diffundieren.

2.) Einzelmolekül-Analyse von chemotaktischen Prozessen mit der Totalreflexions-Fluoreszenz-Mikroskopie (Ueda et al., Universität Osaka, 2001)

2. Erforschung chemotaktischer Zellen TIRFM (Total internal reflection fluorescence microscopy) : Totalreflexion dichtes Medium dünnes Medium Intensität Eindringtiefe (einige hundert nm) Photonen tunneln in das Fluorophor Vorteil: sehr geringe Hintergrundfluoreszenz evaneszentes elektromagnetisches Feld Objektiv

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Dictyostelium-Zellen reagieren chemotaktisch auf cAMP Chemotaxie spielt wichtige Rolle bei: - Immunsystem - Ausbildung neuronaler Netze - Morphogenese wichtiger Botenstoff, der aus ATP gebildet wird und zur Steuerung von Zellfunktionen dient. zyklisches Adenosin-Monophosphat (cAMP): der Schleimpilz Dictyostelium discoideum

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Die chemotaktische Reaktion wird durch Rezeptoren an der Zelloberfläche und durch G-Protein-abhängige Signalübermittlung ermöglicht: cAMP Zellmembran Rezeptor Enzym G-Protein GTP Aktivierung Umbau des Zellskeletts G-Protein GTP GDP GDP

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Experiment: Echtzeit-Abbildung von einfach fluorophorisch markierten cAMP-Molekülen, die an die Oberfläche einer Dictyostelium-Zelle gebunden sind. TIFRM-Bild der Dictyostelium-Zelle vor Abwaschen von un-gebundenem Cy3-cAMP Gleich nach Zugabe des cAMP beginnt dieses, sich an die Membran zu binden und sich lateral zu bewegen. einzelne, fluoreszierende Cy3-cAMP-Moleküle

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Verfolgung einzelner Fluoreszenzpunkte über mehrere Minuten: laterale Beweglichkeit mit D = (2,7 ± 1,1) · 10-10 cm2/s Diffusion einzelner cAMP-Rezeptor-Komplexe letztes Bild: Trajektorien meistens sehr lineare Bewegungen mit gelegentlichen Zwischenstopps  evtl. Wechselwirkung mit Zellskelett REM-Aufnahme eines Zellskeletts

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Erzeugung eines cAMP-Konzentrationsgradienten  Zellen bewegen sich linear in Richtung des Gradienten. cAMP-Konzentrationsgradient wird mit einer Mikropipette erzeugt. Verfolgung der cAMP-Rezeptor-Komplexpositionen: Pfeil: Konzentrationsgradient

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Konzentrationsgradient und Bewegungsrichtung vordere Hälfte: 12% mehr Rezeptoren als auf der hinteren Hälfte 2. Erforschung chemotaktischer Zellen Es befinden sich auf der Membran im Mittel mehr Rezeptoren an der nach vorne gerichteten Zellhälfte: Aber: Kein Unterschied im Diffusionskoeffizienten Die meisten Cy3-Punkte blieben nur einige Sekunden lang an der Membran haften: Punkte, die seit t=0 an der Membran haften Dissoziationsratenunterschied zwischen vorderer und hinterer Hälfte schneller cAMP-Austausch langsamer

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Wichtige Entdeckung: Dissoziationsratenunterschied zwischen der einen und der anderen Seite der Zelle existiert auch dann, wenn kein Konzentrations-Gradient vorhanden ist !  zellinterne Polarisation legt die Zellvorderseite fest ! Zwei mögliche Ursachen für schnelleren cAMP-Austausch: - Rezeptor-Phosphorylierung oder - besondere Wechselwirkung zwischen G-Protein und Rezeptor Phosphorylierung: Chemische Reaktion (Anhängen einer Phosphatgruppe), die die Rezeptoraffinität um das 3- bis 6-Fache verringert. selbes Experiment diesmal mit zwei verschiedenen Dictyostelium-Mutationen: 1. Mutation: phosphorylierte Rezeptoren  keine Veränderung  Phosphorylierung ist nicht die Ursache 2. Mutation: „defektes“ G-Protein  keine Dissoziationsunterschiede mehr !  Wahrscheinlich ist G-Protein-Rezeptor-Wechselwirkung die Ursache.

2. Erforschung chemotaktischer Zellen Überprüfen, ob Rezeptor - G-Protein - Wechselwirkung vorliegt: cAMP-Austauschgeschwindigkeit ohne (-) und mit (+) Zugabe von GTP. dunkel-/hellgrau/weiß: Zusammensetzung des Fits aus einer schwach/mittel/stark abklingenden Komponente unveränderte Zelle 1. Mutation 2. Mutation (2 Varianten) Beobachtung der Auswirkungen bei Zugabe von GTP und GDP: - GTP verursacht Zunahme der cAMP- Dissoziationsrate - GDP hat keinen Effekt  G-Protein beeinflusst das Liganden-Bindungsverhalten. Fragen, die noch zu beantworten sind: Ist die Polarisation des Dissoziationsverhaltens eine spezielle Eigenschaft der Membran oder des Zellskeletts? Kann sich die Polarisation, also die Auszeichnung der Vorderseite zeitlich verändern?

3.) Echt-Zeit-Aufzeichnung des Infektionsvorgangs eines Adeno-assoziierten Virus mit Single Virus Tracing (Bräuchle et al., LMU München, 2001)

 sehr hohe Detektorempfindlichkeit notwendig 3. Single Virus Tracing Detaillierte Kenntnisse über virale Infektionsprozesse sind von großer Bedeutung für antivirale Medizin und Gen-Therapie. Adeno-assoziierter Virus (AAV): kleiner Virus, der den Adenovirus zur Ausbreitung benötigt. Verursacht keine Krankheit beim Menschen  interessant für Gen-Therapie Adeno-assoziierter Virus Viren werden mit nur ein oder zwei Cy5-Molekülen markiert, um den natürlichen Vorgang nicht zu beeinflussen.  sehr hohe Detektorempfindlichkeit notwendig Beobachtung mit der Weitfeldmikroskopie

In der Nähe der Zellmembran: - Beschleunigung in Richtung Zellwand 3. Single Virus Tracing Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit nTouch Kontakten Fits In der Nähe der Zellmembran: - Beschleunigung in Richtung Zellwand - Wiederholte Berührungsereignisse, unterbrochen von kurzer Diffusion in Zellnähe Im Durchschnitt 4,4 Berührungen Außerhalb der Zelle: normale Diffusion mit D = 7,5 μm2/s

mittlere Berührungszeit: 62ms 3. Single Virus Tracing mittlere Berührungszeit: 62ms mittlere Kontaktdauer: 3,2s (erster ... letzter Kontakt) Häufigkeit n der Trajektorien ohne Penetration mit der mittleren Berührungszeit t Fit Eindringen in die Zelle: mittlere, zum Eindringen benötigte, Kontaktzeit: 1,2s Eindringeffizienz: 13% Membran ist eine wichtige Barriere gegen Viren. Trajektorien mit Penetration:

47% normale Diffusion (<r2> ~ t) Im Zellplasma: 3. Single Virus Tracing 47% normale Diffusion (<r2> ~ t) D = 0,6 μm2/s zwei verschiedene Komponenten: - freies Virus - Virus in Endosom (Stokes-Einstein: 2R  50 nm) Jedes Endosom enthielt stets nur ein AAV. D = 1,3 μm2/s 45% anomale Diffusion (<r2> ~ Dt α) 0,3μm2/s < D < 1,5μm2/s 0,5 < α < 0,9  Behinderung der Diffusion durch feste Bestandteile des Plasmas MSD-Plots von Partikel im Plasma: normale Diffusion, freies AAV normale Diffusion anomale Diffusion endosomal 8% gerichtete Bewegung! (<r2> = 4Dt + (vt)2) Behandlung mit Nocodazol  gerichtete Bewegung verschwindet  Mikrotubuli-Transport durch Ausnutzen von Motorproteinen wie Kinesin oder Dynein. 1,8μm/s < v < 3,7μm/s Nocodazol: wird zum Depolymerisieren von Mikrotubuli verwendet.

Behandlung mit Nocodazol  gerichtete Bewegung im Im Zellkern: 3. Single Virus Tracing 57% normale Diffusion 0,4μm2/s < D < 1,3μm2/s <D> = 0,85μm2/s 17% anomale Diffusion 0,25μm2/s < D < 0,9μm2/s 0,6 < α < 0,9 26% gerichtete Bewegung! Einige Virusmoleküle bewegen sich nacheinander auf dem selben Pfad. Alle Pfade waren regional gleich orientiert. 0,2μm/s < v < 2,8μm/s Behandlung mit Nocodazol  gerichtete Bewegung im Zellkern verschwindet  Aktiver Transport in der Kernregion, obwohl dort bisher keine Mikrotubuli und Motorproteine nachgewiesen werden konnten!

Die wichtigsten Ergebnisse des Single Virus Tracing: Unterschiedliche Bewegungsarten und -Phasen: I.) Beschleunigung in Richtung Zellwand (1), mehrere aufeinanderfolgende Virus- Membran-Kontakte (2) und schnelle Endozytose (3) II.) freie und anomale Diffusion des Endosoms mit dem Virus im Plasma und im Kern (3, 4) III.) gerichtete Bewegung durch Ausnutzung von Motorproteinen im Plasma und in Röhrchenstrukturen des Kerns (4) 15 Minuten nach jeder Behandlung waren 50% der Zellen von mindestens einem Virusmolekül befallen!

Quellen: [1] Bacia et al. (2002): Probing the Endocytic Pathway in Live Cells Using Dual-Color Fluorescence Cross-Corelation Analysis. Biophysical Journal 83(2) 1184-1193. [2] Ueda et al. (2001): Single-Molecule Analysis of Chemotactic Signaling in Dictyostelium Cells. Science Vol 294 864-867. [3] Bräuchle et al. (2001): Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection Pathway of an Adeno-Associated Virus. Science Vol 294 1929-1932.

Bildmaterial: