Lanthanoide als Marker in der Fluoreszenzspektroskopie Jan Hoyer Nora Schulze

Gliederung 1. Vor- und Nachteile von Lanthanoidenmarkern 2. Allgemeine Vorgehensweise 3. Anwendungen 4. Literatur

Anforderungen an Markersubstanzen gutes Signal/Rausch-Verhältnis kleine Nachweisgrenze einfache Handhabung; Verfügbarkeit der Substanzen möglichst geringe Beeinflussung des zu untersuchenden Systems

Vorteile von Ln-Fluoreszenzmarkern keine Strahlenschäden (vgl. radioaktive Marker) scharfe Banden, geringer Hintergrund  gutes S/N  geringe Nachweisgrenze (bis fmol-Bereich) kurze Messdauer (Sekundenbereich) Nachteil: teurer als herkömmliche Fluoreszenzmarker!

Besonderheiten der Fluoreszenz bei Lanthanoiden Lebensdauer des angeregten Zustandes: 0,1 – 1 ms → zeitaufgelöste Unterscheidung von Hintergrundsignal möglich Stokes-Verschiebung über 250 nm geringe Extinktionskoeffizienten → geringes Hintergrundsignal → Sensibilisierung durch „Antennenliganden” notwendig eingesetzte Lanthanoide: Eu, Tb, Sm, Dy

Stokes-Verschiebung Abstand zwischen Absorptions- und Emissionsmaximum einer fluoreszierenden Substanz → je größer die Verschiebung, umso weniger Überlappung von Absorptions- und Emissionsspektrum

Antennenliganden - Prinzip Chelatligand bindet Marker und absorbiert eingestrahltes Licht Energie wird auf Lanthanoidion übertragen und als Fluoreszenzsignal emittiert

Antennenliganden - Beispiele hohe KoZ verhindert Bindung von Wasser an Ln, da sonst Desaktivierung

Anwendungen DELFIA („dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay“) Immunoassays ähnlich ELISA oder RIA Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen TR-FRET („time resolved fluorescence resonance energy transfer“) → z. B. Untersuchung der Oligomerisierung von Rezeptoren in lebenden Zellen Einführung von Ln-Bindungsstellen in Proteine → unmittelbare Bestimmung von Expressionsleveln → Visualisierung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen

DELFIA Beispiel: Bestimmung von Metallothioneinen → Expression u. a. als Antwort auf Kontamination mit Schwermetallionen (Komplexierung) zunächst Inkubation mit MT-Antikörper, an diesen bindet sekündärer Antikörper →markiert mit nicht-fluoreszierendem Chelatkomplex (z. B. Eu-DTTA, gebunden über Isothiocyanatgruppe an ε-Aminogruppe von Lys) Erniedrigung des pH führt zu Freisetzung von Ln aus Komplex, Bindung an Antennenliganden → Nachweis

Vorteile von DELFIA empfindlicher als ELISA und RIA kostengünstiger und weniger zeitaufwändig als RIA, keine radioaktive Strahlung Möglichkeit der Automatisierung Verwendung mehrerer Marker gleichzeitig möglich, da unterschiedliche Lebensdauern des angeregten Zustandes und andere Emissionsprofile von Eu, Tb, Sm, Dy → Kosten- und Zeiteinsparung

Weitere Möglichkeiten der Verwendung von Lanthanoiden Lanthaniden-Shift-Reagenzien in NMR Beschleunigung der Proteinstrukturbestimmung mittels RKSA

Quellennachweis Life Sciences 77 (2005), 361-371 Analytical Biochemistry 137 (1984), 335-343 Chembiochem 4 (2003), 265-271