Moderne Reproduktionsmedizinische Techniken F. Fischl Universitätsfrauenklinik Mainz/Wien Universitäts-Kinderwunschzentrum Johannes Gutenberg Universität Mainz

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Image der Reproduktionsmedizin ist nach außen eher schlecht Ängste - Vorbehalte Angst vor Missbrauch „Designerbaby“ zB. durch PID unter Kollegen : ebenfalls schlechtes Image Reske 2003 Embryonenschutzgesetz droht mit Gefängnis und hohen Geldstrafen! „Patienten sehen dies anders“ Seeler, 2003 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

A R T – Artificial Reproductive Techniques Moderne Stimulationstherapien – long, short, ultra-short (rFSH/rLH -GnRH- Agonisten/Antagonisten etc.) AIH (artificial insem. homologous) IUI - intauterine insemination AID (artificial insem. donor) IVF – In vitro Fertilisation ICSI – Intacytoplasmatic Sperm Transfer MESA - Mikrochirurgische epidymale Spermatozonaspiration TESE – Testikuläre Spermien Extraction aus Hoden IMSI - Intrazytoplasmatische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion

A R T – Artificial Reproductive Techniques PICSI - Methode zur Selektion reifer Spermien in Picsi-Schale TUNEL - Terminale Desoxyribosyl-Transferase (TdT) mediated dUTP nick end labeling Assisted Hatching - Schlüpfhilfe ET „klassischer Embryotransfer“ - Tag 2 - 3 Blastocystentransfer - Tag 4 - 5 Kryoverfahren – „slow cooling“ versus Vitrifikation Präimplantationsdiagnostik – Polkörperdiagnostik (PKD) Präimplantationsdiagnostik (PID)

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Stimulationsbehandlung Kontrollierte ovarielle Stimulation Zielsetzung:  Heranreifen eines od. mehrerer Follikel aus Follikelkohorte  Bei IVF / ICSI: – Vermeidung der spontanen Ovulation – Gewinnung mehrerer reifer Eizellen (Metaphase II)  Bei IUI + VZO*: – Heranreifen von 1 – max. 3 Eizellen * Verkehr zum ovul. Optimum * Verkehr zum Optimum 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Nach 2-3 Wochen Kontrolle der „down regulation“ Long-Agonisten Schema mit rFSH Progesteron Vag. Transvaginale Punktion Nach 2-3 Wochen Kontrolle der „down regulation“ 10000 IE HCG 150 – 300 IE rFSH ab Tag 3 Follikel > 18mm E2> 350 pro Follikel Embryotranfer Zwei – bis 8zeller GnRH – Agonist Depot Tag 19-21 des Vorzyklus vag.Sono ev.E2, Menstruation 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Embryotransfer 2-8 Zellstadum Short Antagonistenschema mit Mehrfachgabe Progesteron Vag. GnRH-Antagonist 0,25 mg Tranvaginale Punktion 5-1000 IE hCG rFSH 1 2 3 4 5 7 8 9 Embryotransfer 2-8 Zellstadum Stimulationstage Vag. Sono ev. E2 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

IMSI Intrazytoplasmische Morphologisch Selektierte Spermien Injektion Spermienfaktoren, die negativen Einfluss auf die embryonale Entwicklung haben, sind v.a. durch eine verminderte Spermienreife bedingt. Hierzu zählen u. a. DNA-Fragmentationen. Alle bisher zur Verfügung stehenden Diagnosemittel waren invasiv, wodurch eine Weiterverwendung der Spermien nicht möglich war.   Die IMSI erlaubt ein Screening der Spermien bei sehr hoher Vergrößerung mit einem speziellen Invertmikroskop mit Videokamera und Computer (6000x – 10 000x) ohne Färbung in Echtzeit. Dadurch kann ein Spermium bezüglich seiner morphologischen Integrität seines Nukleus analysiert werden. Zahlreiche Publikationen haben gezeigt, dass eine Prä-Selektion des Spermaozoons für eine erfolgreiche ICSI essentiell ist. ICSI mit Spermien, die mittels hoher Vergrößerung ausgewählt wurden, ergaben eine höhere Schwangerschaftsrate, speziell in Fällen wo das Ausmaß an DNA-Fragmentationen im Spermium besonders hoch war. 400x IMSI ICSI

IMSI Bartoov etablierte ein System für eine Selektion bei hoher Vergrößerung, ungefärbte, Echtzeit hochauflösende Untersuchung der Organellen von motilen Spermien Bartoov et al., NEJM 2001 Bartoov et al., J. Androl. 2002    Bartoov et al., Fertil. Steril. 2003 Ergebnisse ICSI mit abnormalen Spermatozoen: Reduktion der SS-Rate: 20,2% versus 36,7% Reduktion der Implantationsrate: 9,6%  versus 18,7% Prä-Selektion der Spermien ist essentiell für eine erfolgreiche ICSI (De Vos et al., Hum. Reprod. 2003) X 400

Kombination von Spindelanalyse & IMSI Spindel(view)analyse Nicht invasive Darstellung der Spindel mittels computerassistierter Polarisationsmikroskopie - Darstellung der 3 Schichten der Zona pellucida Metaphase II – Eizellen Winkel zwischen erstem Polkörperchen (bei 12:00 Uhr) und meiotischer Spindel (ca. 30° abweichend) bei einer menschlichen Eizelle Kombination von Spindelanalyse & IMSI Die Kombination könnte zur weiteren Steigerung der Schwangerschaftsraten bei ICSI führen mit Senkung der Abortus-Raten – entsprechende randomisierte multi-center Studien müssen das jedoch noch beweisen 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

PICSI Eine Methode zur Selektion reifer Spermien im Rahmen der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI). Die Picsi-Schale ermöglicht in nicht invasiver Form die Auswahl von genetisch integeren, d.h. reifen Spermien durch Hyaluronsäure Spots. Die Köpfe reifer Spermien tragen eine spezifischen Rezeptor für Hyaluronsäure (Hyaluronan). Hyaluronan ist eine wesentliche Komponente der Hülle, welche die Eizelle umgibt. Unreife Spermien verfügen nicht über diesen Rezeptor Durch den sogenannten Hyaluronan-Bindungstest werden Spermien aufgrund von bestimmten Membran-Bindungseigenschaften selektiert. Alle bindenden Spermien sind reif und zeigen keine DNA-Degradierung auf. Diese gebundenen Spermien können für die ICSI verwendet werden.                                                                                                                              

FIS Repromed - Gran Canaria 08 TUNEL - Test DNA Fragmentierung von Spermatozoen als prognostischer Faktor - Analyse z.B. mittels SCNA - Chromatine Structure Assay COMET Assay und TUNEL Assay – dieser Assay misst DNA-Brüche direkt. Eine terminale Transferase hängt modifizierte Nukleotide an die 3`OH -Enden der Bruchstelle. Diese Methode ist sowohl für Lichtmikroskope, wie auch Fluoreszenzmikroskope geeignet. Durch erhöhte DNA-Fragmentierung von Spermatozoen wird die Schwangerschaftsrate bei etwa jedem Paar mehr als halbiert. 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

FIS Repromed - Gran Canaria 08 IMSI und PICSI, sowie der TUNEL-Test erlauben in bestimmten Fällen eine Verbesserung der Ergebnisse:     Bei fehlender Befruchtung nach ICSI,     bei fehlgeschlagener Implantation,     bei schwerer Teratozoospermie,     bei erhöhter DNA-Fragmentation und vielleicht auch     bei idiopathischer Infertilität? Es fehlen derzeit Daten aus Studien mit Evidenzklasse I und II 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Embryonale Entwicklung - Hatching Blastocyste 1 Zona pellucida 2 Trophoblast (äussere Zellmasse) 3 Hypoblast (Teil der inneren Zellmasse) 4 Blastozystenhöhle 5 Epiblast (Teil der inneren Zellmasse) „hatching“ Die Blastozyste schlüpft aus der teils aufgelösten Membrana pellucida. Man unterscheidet den Trophoblasten, der die äußere Zellmasse bildet und den Embryoblasten (innere Zellschicht mit Epi- und Hypoblasten) sowie die Blastozystenhöhle. Erst nach dem Schlüpfen aus der Zona pellucida kann der Embryo direkt mit dem Endometrium in Kontakt treten.

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Erfolgsfaktor Assisted Hatching Klare Aussage! Definitiv wird die Schwangerschaftsrate erhöht bei Frauen... mit mehreren Misserfolgen bei IVF/ICSI mit reduzierter Prognose OR 1,33 (95% CI 1,12 bis 1,57) Beispiel: von 25% auf 28% bis 39% Auch die Mehrlingsrate steigt.  „Hatchende“ Blastocyste Seif MMW, Edi-Osagie ECO, Farquhar C, Hooper L, Blake D, McGinlay P. Assisted hatching on assisted conception (IVF & ICSI). Cochrane Database of Systematic Reviews 2006, Issue 1. Art. No.: CD001894. 23 Studien mit guter Qualität und 2889 Frauen mit 954 Schwangerschaften Jelinkova L, Pavelkova J, Strehler E, Paulus W, Zivny J, Sterzik K. Improved implantation rate after chemical removal of the zona pellucida. Fertility and Sterility 2003;79 Suppl 6:1299-1303. 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Präimplantationsdiagnostik Preimplantation Genetic Testing (PGT) Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Preimplantation Genetic Screening (PGS) 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Polkörperdiagnostik (PKD) Entfernung eines/mehrerer Nuclei von Oozyten (Polkörperchen) oder Embryonen (Blastomere/Trophektoderm) Untersuchung einer mütterlichen genetischen oder chromosomalen Veränderung des haploiden weibl. Chromosomensatzes durch die Untersuchung es ersten und zweiten Polkörper im Ablauf einer IVF/ICSI – indirekte Diagnostik einer Eizelle Testung auf Mutationen von Gensequenzen Aneuploidie

Polkörperdiagnostik (PKD) Gilt als ein in Erprobung befindliches Verfahren Indikationen:  Erkennung eines spezifischen genetischen, einschließlich chromosomalen kindlichen Risikos mittels indirekter Diagnostik der Eizelle  Erkennung unspezifischer chromosomaler Risiken im Rahmen von IVF zur möglichen Erhöhung der Geburtenrate – bisher in der Literatur sehr kontroversiell beurteilt, nach letzten Studien Vorteil eher nicht gegeben

Polkörperdiagnostik (PKD)  Die PKD ist an die Anwendung an eine IVF/ICSI Behandlung geknüpft, auch wenn keine Fertilitätsstörung vorliegt  Nachdem diese Untersuchung vor Bildung eines Embryos durchgeführt wird, ist das Embryonenschutzgesetz davon nicht berührt  Nur Veränderungen ♀ können damit festgestellt werden  Die Untersuchung am 2. Polkörperchen gelingt nicht mmer FISH X/Y, 13, 16, 18, 21, 22

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Was bringt PGD wirklich? PGD bei fortgeschrittenem mütterlichen Alter Die Wirksamkeit der Präimplantationsdiagnostik (PGD) bei Frauen mit "fortgeschrittenem Alter" wurde vorausgesetzt, ohne in RCTs überprüft zu sein. Die neue große Multizenterstudie findet nun keinen Vorteil der PGD, sondern ganz im Gegenteil, signifikant weniger Schwangerschaften (ongoing) und Lebendgeburten als bei Verzicht auf die Diagnostik. Mastenbroek S, Twisk M, van Echten-Arends J, et al. In vitro fertilization with preimplantation genetic screening. N Engl J Med 2007;357:9-17 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

FIS Repromed - Gran Canaria 08 Durchführung eines Blastozystentransfers (BcT) abhängig von  Alter der Frau  Anzahl der Oocyten  Qualität der Oocyten  Qualität der kommerziell erhältlichen Medien  nicht bei poor Respondern (keineVerbesserung der Ergebnisse) 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Vorteile der Blastozystenkultur  Gewinnung der besten lebensfähigen Embryonen nach Überwindung der Entwicklungsblockade in den in vitro Kulturen zwischen Tag 2-3 (4-8 Zellstadium)  Bessere physiologische Bedingungen und Synchronisation zwischen Endometrium und Embryo-Entwicklungsstadium  Im 2-4 Zellstadium ist die Zona pellucida durch die Kulturbedingungen in vitro so verhärtet, dass es nur schwer zum Hatchen kommt  Völlige Entfernung der Zona pellucida mit enzymatischen Methoden und Transfer von zona pellucida freien Blastozysten für eine bessere Implantation (Eine Möglichkeit in der Zukunft?) 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Methoden der Kryokonservierung „slow cooling“ – langsames Einfrieren mittels computergesteuerten Freezingapparaten (z.B. – 0,30C/min., bei niedrigen Kryoprotektiva ~10%) Vitrifikation – ultraschnelles Abkühlen > -10.000oC/min wobei die Zellen direkt in einen amorphen Zustand (Verglasung) übergehen (Martino et al., 1996) Anwendung im medizinischen Bereich Reproduktionsmedizin  Fertilitätsprophylaxe  Stammzellforschung

Methode der aseptischen Vitrifikation Relativ langsames Abkühlen (-600oC/min) Ultraschnelles Erwärmen (6.000oC/min) Parallel Entfernung der Kryoprotektoren Kein Risiko einer Kontamination Isachenko V, Montag M et al., Human Reproduction, 2005

Zusammenfassung Vitrifikation ist die Methode für  Germinal Vesikel Eizellen  Metaphase-II-Eizellen (Eizellspende)  Blastozysten  Ovargewebe ? Kommerzielle Medien verfügbar – Asept. Vitrifikation ist möglich Andrologie:  Kryokonservierung ist fester Bestandteil zur Fertilitätserhaltung Gynäkologie:  Kryokonservierung erhöht die kumulative Schwangerschaftsrate bei IVF/ICSI  Kryokonservierung nach in-vitro Maturation ist derzeit eher umstritten (ethisch/biologisch) Onkologie:  Kryokonservierung primär zur Autotransplantation und Hormonsubstitution, sekundär zur Fertilitätserhaltung

Zukunftsaspekte in der ART  Eizell- Embryo- und Samenbanken  Selektion durch Präimplantationstechniken?  Ovarian tissue banking (OTB)  In vitro maturation (IVM)  Autologe Ovartransplantation nach Kryopreservation  Schwangerschaften in den Wechseljahren mit Hilfe kryokonservierter Eizellen (aktuell durch starken Anstieg der Lebenserwartung!)

Zukunftsaspekt - Ovarian Tissue Banking  Grosse Anzahl an Primordialfollikeln im Gewebe vorhanden  höhere Erfolgschancen?  Keine Stimulation, dafür aber LSK notwendig  Kurzfristig durchführbar (Op. Freigabe)  Natürliche Empfängnis denkbar  Als autologe Hormonersatztherapie denkbar ______________________________________________________ Ovarielle Gewebeentnahme Bestrahlung/Chemotherapie/OP  Retransplantation des ovariellen Gewebes

Ovarian Tissue Banking - Einschlusskriterien Primäres Kriterium: Erhaltung der Fertilität - Altersgrenze: ca. 35 - 37a - FSH < 10 - LSK möglich - Keine anamnestische Bestrahlung - Frühes Stadium der Chemotherapie Ganzes Ovar oder Teilovarektomie? Ovarektomie: Lokale oder Ganzkörperbestrahlung Tangentiale Resektion: Chemotherapie ohne Bestrahlung

FIS Repromed - Gran Canaria 08 In-vitro-Maturation (IVM) Gewinnung von Ovargewebe Isolierung von unreifen Oozyten (Primordialfollikel, Primärfollikel) künstliche Reifung (FSH / HCG)  IVF/ICSI-Therapie In-Vitro-Maturation bisher nur im Mausmodell gelungen (Smitz et al., Hum Reprod, 1999) 20.04.2017 FIS Repromed - Gran Canaria 08

Erfolgsfaktor IVM? IVM ist die in vitro Reifung der Oocyten vom GV-Stadium zum Metaphase II Stadium IVM-Methodik: Aspiration unreifer Oocyten in nicht oder niedrig dosiert stimulierten Zyklen In vitro Maturation (IVM) ist bisher wenig untersucht in RCTs. Keine valide Aussage aus prospektiv kontrollierten Vergleichstudien zum Erfolg gegen „normale IVF“ möglich. Priming mit FSH/hMG oder unstimuliert punktieren? Mit oder ohne hCG Gabe? Diese Fragen sind nicht zuverlässig beantwortet. Hesham Al-Inany. Female infertility. Clinical Evidence 2005

„Future Perspectives“ Prophylaktische bilaterale Ovarektomie bei Risikopatientinnen (z.B. BRCA 1 & 2) aber auch OTB bei erst späteren Kinderwunsch ohne Erkrankung dadurch Erhaltung der Fertilität bei möglichen spätem Kinderwunsch Vorsorgliche Einlagerung zur späteren biologischen HRT ev. anti aging bzw. „better aging“ Therapie