Systematische Identifizierung eines Arzneistoffgemisches Seminar zum Praktikum Pharmazeutische Chemie III

Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und ggf. Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe Gruppenreaktionen Spezielle Reaktionen IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

Vorproben Organoleptische Prüfungen Löslichkeitsversuche Färbung in bestimmten Säuren oder Basen Farbreaktionen

Organoleptische Prüfungen Farbe Geruch manche Substanzen besitzen charakteristischen Geruch, dieser kann auch erst beim Glühen entstehen z.B. Zucker u. andere Kohlenhydrate entwickeln Karamellgeruch ocker gelb Tetracyclin Menadion

Löslichkeit in NaOH: Carbonsäuren Phenole Beispiele? ASS, Penicilline Clioquinol Beispiele?

Löslichkeit in H2SO4: Basen Atropin, Chinin, Lidocain Beispiele?

Färbung in bestimmten Säuren oder Basen Beispiele? NaOH H2SO4 HNO3 Hellgelb Orange

Farbreaktionen mit Froehdes Reagenz mit Mandelins Reagenz mit Marquis Reagenz Ammoniummolybdat in H2SO4 conc. Ammoniumvanadat in H2SO4 conc. Froehde/Mandelin: Oxidation (eigentl. bekannt aus DAB?) Formaldehyd-Lsg. in H2SO4 conc.

Marquis-Reaktion am Beispiel Morphin + + + violett + H+ mesomeriestabilisiertes Oxonium-Carbenium-Ion Ox.

Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe Gruppenreaktionen Spezielle Reaktionen IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

Stas-Otto-Trennungsgang Theorie:  unterschiedliche Verteilung von Substanzen zwischen wässriger und organischer Phase  Salzbildungsvorgänge  unterschiedliche Löslichkeiten

Verteilungsvorgänge Nach dem Nernstschen Verteilungsgesetz gilt allgemein: hier:

Verteilungsbeispiel  Nach dreimaligem Ausschütteln:  Chloramphenicol wird bei pH 1 mit Ether ausgeschüttelt (Stas-Otto- Gruppe l)  100 mg werden in 50 ml wässriger Phase vorgelegt  Wie viel Arzneistoff liegt nach dreimaligem Ausschütteln mit je 50 ml TBME bzw. nach einmaligem Ausschütteln mit 150 ml TBME in der Etherphase vor?  Löslichkeit: Wasser 1 g : 400 ml Ether 1 g : 400 ml  Nach dreimaligem Ausschütteln: ■ 50 % liegen nach dem ersten Ausschütteln in der Etherphase vor, das sind 50 mg ■ nach dem zweiten Ausschütteln weitere 50 %, das sind 25 mg ■ nach dem dritten Ausschütteln nochmals 50 %, also 12.5 mg  Nach dreimaligem Ausschütteln liegen also 87.5 mg in der Etherphase vor!!

Verteilungsbeispiel  Chloramphenicol wird bei pH 1 mit Ether ausgeschüttelt (Stas-Otto-Gruppe l)  100 mg werden in 50 ml wässriger Phase vorgelegt  Wie viel Arzneistoff liegt nach dreimaligem Ausschütteln mit je 50 ml TBME bzw. nach einmaligem Ausschütteln mit 150 ml TBME in der Etherphase vor?  Löslichkeit: Wasser 1 g : 400 ml Ether 1 g : 400 ml  Nach einmaligem Ausschütteln: ■ in beiden Phasen liegen gleiche Konzentrationen an Arzneistoff vor ■ in der Etherphase befindet sich daher die 3-fache Masse (3-faches Volumen!!)  Nach einmaligem Ausschütteln liegen also 75 mg in der Etherphase vor!!

Stas-Otto-Trennungsgang Vorbereitung der Probe:  gut durchmischen!!  200 - 500 mg der Probe in ~ 30 ml dest. Wasser aufnehmen  Einstieg in den Trennungsgang durch Ansäuern auf pH 1 mit H2SO4

Phase Ι: Saure Etherphase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Phase Ι: Saure Etherphase Säuren, Phenole, Ureide, Neutralstoffe 3 x 25 ml TBME ausschütteln Mit 8 %iger NaHCO3-Lsg. neutralisieren, mit 10 %iger Weinsäure-Lsg. auf pH 4-5 einstellen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase II: Saure Ethylacetatphase Schwache Basen, EE-lösliche Säuren, Phenole, Neutralstoffe 3 x 30 ml 0,5 N NaOH Phase III: Alkalische Etherphase Basen Wässrige Phase mit 3 N H2SO4 ansäuern und 3 x mit 50 ml TBME ausschütteln Mit 3 N NaOH auf pH > 10 alkalisieren, 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Phase IB Neutralstoffe Mit 3 N H2SO4 neutralisieren und mit 6N NH3 auf pH 9 bringen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase IV: Ammoniakalische Ethylacetatphase Phenolbasen, EE-lösliche Basen Phase IA Säuren, Phenole, Ureide Phase V: Wässrige Phase Nicht ausschüttelbaren Substanzen Säuren, KH, Aminosäuren, Quart. Ammoniumverb.

Phase I: Saure Etherphase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Phase I: Saure Etherphase Säuren, Phenole, Ureide, Neutralstoffe 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Ibuprofen 3 x 30 ml 0,5 N NaOH + + H O O H O O hydrophiles Anion; wasserlöslich Wässrige Phase mit 3 N H2SO4 ansäuern und 3 x mit 50 ml TBME ausschütteln lipophile Säure; löslich in TBME Phase IB Neutralstoffe Paracetamol O O H N H N + H + O O H Phase IA Säuren, Phenole, Ureide hydrophiles Anion; wasserlöslich lipophil; löslich in TBME

Phase II: Saure Ethylacetatphase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Wasser Ether Base 1 + >1000 1 + 250 Hydro-chlorid 1 + 40 Mit 8 %iger NaHCO3-Lsg. neutralisieren, mit 10 %iger Weinsäure-Lsg. auf pH 4-5 einstellen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln. Phase II: Saure Ethylacetatphase Schwache Basen, EE-lösliche Säuren, Phenole, Neutralstoffe Papaverin O H O O O H O H H O H H O H M e O M e O H O H O O H wasserlöslich + N N M e O M e O H O O H O M e O M e O M e O M e wasserlöslich löslich in Ethylacetat

Alkalische Etherphase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Mit 3 N NaOH auf pH > 10 alkalisieren, und 3 x mit 25 ml TBME ausschütteln Phase III: Alkalische Etherphase Basen Methadon H + + N a O H + + Na + H2O

Phase IV: Ammoniakalische Ethylacetatphase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Morphin Mit 3 N H2SO4 neutralisieren und mit 6 N NH3 auf pH 9 bringen. 3 x mit 25 ml EE ausschütteln Phase IV: Ammoniakalische Ethylacetatphase Phenolbasen, EE-lösliche Basen

Phase V: Wässrige Phase 200 – 500 mg Substanz in 30 ml dest. Wasser lösen, mit 3 N Schwefelsäure auf pH 1 ansäuern und mit Wasser auf 60 ml auffüllen Ascorbinsäure Metamizol-Na Phase V: Wässrige Phase Nicht ausschüttelbare Säuren, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Quart. Ammoniumverbindungen

Allgemeine Vorgehensweise Vorproben Identifizierung und Abtrennung des Trägers Ausschütteln in verschiedene Gruppen (Stas-Otto-Trennungsgang) Systematische Dünnschichtchromatographie (evtl. Detektion) Identifizierung der isolierten Arzneistoffe Gruppenreaktionen Spezielle Reaktionen IR-Spektroskopie und andere analytische Methoden

Gruppenreaktionen auf… □ Stickstoffverbindungen □ Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ reduzierende Stoffe □ Sonstige

Stickstoffverbindungen Welche funktionelle Gruppen? □ a-Aminosäuren □ primäre aromatische Amine □ Pyridinderivate R

Nachweis von α-Aminosäuren Ninhydrin-Reaktion Versetzen mit Ninhydrin-Lösung, danach Erhitzen bis zum Sieden

… am Beispiel Levodopa + H2O + - H2O - H2O CO2 - H2O

… am Beispiel Levodopa H2O + + H2O - H2O violett - H+

Nachweis primärer aromatischer Amine Diazo-Kupplungsreaktion eventuell nach vorheriger Hydrolyse z.B. Furosemid auch nach Reduktion z.B. Metronidazol Lösen der Substanz in HCl und versetzen mit Diazo-Reagenz l (Natriumnitrit) anschließend Eingießen dieser Lösung in Diazo-Reagenz ll (2-Naphtol in NaOH)

… am Beispiel Furosemid Reaktion nach vorheriger Hydrolyse mit 3-N HCl orange-rot + NaNO2 + 2-Naphtol HCl au

Nachweis von Pyridinderivaten Zincke-König-Spaltung Verreiben der Substanz mit 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol und anschließendes Schmelzen Lösen der erkalteten Schmelze in ethanolischer KOH

… am Beispiel Nicotinamid + Cl- rot OH- OH-

Gruppenreaktionen auf… □ Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen Stickstoffverbindungen □ Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ reduzierende Stoffe □ Sonstige

Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ Carbonsäuren und –derivate □ abspaltbarer Formaldehyd

Nachweis von Carbonsäuren, Estern, Amiden und Anhydriden Hydroxamsäurereaktion Carbonsäuren nach Aktivierung mit Thionylchlorid Derivate: Reaktion mit Hydroxylamin-HCl-Lösung und Eisen(lll)-chlorid-Lösung

… am Beispiel Ibuprofen Aktivierung der Carboxylfunktion mit SOCl2 rot +NH2OH +FeCl3 auch Penicilline reagieren (in saurer Lösung)

Nachweis von abspaltbarem Formaldehyd Chromotropsäurereaktion Erhitzen der Substanz mit H2SO4 conc. und Chromotropsäure

… am Beispiel Metamizol-Na + 2 Abspaltung von Formaldehyd + + violett

Gruppenreaktionen auf… □ reduzierende Stoffe □ Sonstige Stickstoffverbindungen Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen □ reduzierende Stoffe □ Sonstige

Nachweis reduzierender Verbindungen □ reduzierende Zucker □ olefinische Doppelbindungen

Nachweis von reduzierenden α-Hydroxycarbonyl-Verbindungen Fehling-Reaktion Positive Reaktion auch bei anderen starken Reduktionsmitteln (z.B. Ascorbinsäure) Mischen von Fehling-Reagenz l (CuSO4 x 5 H2O in Wasser) und Fehling-Reagenz ll (Kaliumnatriumtartrat / NaOH / H2O) Zusatz der reduzierenden Verbindung Erwärmen auf dem Wasserbad für bis zu 30 Minuten

… am Beispiel Ascorbinsäure Cu2+ als Kupfer(ll)sulfat schon bei Raumtemperatur Cu+ als Kupfer(l)oxid rotbraun

Prüfung auf olefinische Doppelbindungen Baeyersche Probe Reaktion mit KMnO4 in H2O / Na2CO3 Blindversuch bei solchen Reaktionen immer zweckmäßig

… am Beispiel Amitryptilin rot-violett +7 + +5 + MnO3- + H2O farblos

Gruppenreaktionen auf… □ Sonstige Stickstoffverbindungen Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen reduzierende Stoffe □ Sonstige

Sonstige Reaktion mit 1,3-Dinitrobenzol in KOH □ Zimmermann-Reaktion Nachweis aktiver Methylengruppen Reaktion mit 1,3-Dinitrobenzol in KOH □ Kupplungsreaktion mit diazotierter Sulfanilsäure Lösen der Substanz in NaOH danach Zugabe einer 1:1-Mischung von Sulfanilsäure und 10%iger Natriumnitrit-Lösung

Zimmermann… am Beispiel Diazepam + - - H+ rot Meisenheimer- Salz -

Kupplungsreaktion … am Beispiel Paracetamol + + OH- - rot auch andere Kupplungsreaktionen, z.B. mit Gibb‘s Reagenz -

Gruppenreaktionen auf… Stickstoffverbindungen Substanzen mit Carbonyl- oder Carboxylgruppen reduzierende Stoffe Sonstige

Spezielle Reaktionen □ Vitali-Morin-Reaktion Nitrierbare Aromaten □ Zwikker-Reaktion Barbitursäure Derivate, Hydantoine, Purine....... □ Murexid-Reaktion Purin Derivate (Xanthine), Barbitursäuren, Uracilen □ Chen-Kao-Reaktion 1,2-Aminoethanole □ Thalleiochin-Reaktion Chinolin-Ring mit einer Sauerstoff-Funktion in Pos. 6 □ Coralyn-Reaktion empfindlicher Nachweis für Papaverin

Zusammenfassung  schon Aussehen und Geruch können Hinweise auf Bestandteile eines Stoffgemisches geben  Trennung des Gemisches in verschiedene Gruppen durch einfache Salzbildungs- und verteilungsvorgänge möglich  nach erfolgter Trennung können durch Gruppenreaktionen gewisse Rückschlüsse auf die Struktur der Arzneistoffe gezogen werden auch negative Nachweise geben dabei wichtige Informationen  spezielle Reaktionen dienen der näheren Identifizierung der Stoffe  endgültige Bestimmung der Identität erfolgt dann durch weitere analytische Methoden (DC, IR,…)

Vitali-Morin-Reaktion Nachweis von Tropasäureestern (jedoch sehr unspezifisch) Eindampfen mit rauchender HNO3 Lösen des Rückstandes in Aceton Zugabe von ethanolischer KOH

Vitali-Morin-Reaktion Vitali-Variante  ohne Aceton positiver Ausgang der Reaktion bei allen Verbindungen mit Methylengruppe, die durch Carbonylgruppe aktiviert ist und an einem nitrierbaren Phenylring sitzt z.B. Atropin Morin-Variante  mit Aceton positiver Ausgang bei allen Substanzen, die einen nitrierbaren Aromaten besitzen und mit Aceton als CH-acider Komponente zum Meisenheimer-Salz weiterreagieren können z.B. Lidocain Vitali-Variante spezifischer aber weniger empfindlich

Vitali-Variante am Beispiel Atropin - HNO3 HNO3 + HNO3 R + H2O + OH- , - H2O - H2O - OH- , + H2O - blau-violett

Morin-Variante am Beispiel Lidocain HNO3 OH- - grün Meisenheimer- Salz - H

Zwikker-Reaktion Nachweis von Barbitursäure-Derivaten jedoch nicht sehr selektiv: auch positive Reaktion bei Hydantoinen, Purinen, Sulfonamiden,… Versetzen der Substanz mit Cobaltnitrat in methanolischer Lösung (Zwikker-Reagenz l) danach Zusatz von Piperidin in Methanol (Zwikker-Reagenz ll)

Zwikker-Reaktion Bildung farbiger Komplexe mit Co(ll)-Salzen im alkalischen Milieu je nach LM und Base als Solvat- oder Diamin-Komplex hier: Piperidin dient sowohl zur Deprotonierung, als auch als Ligand Bildung eines tetrahedralen Komplexes mit hoher Empfindlichkeit vgl.: Arzneibuch: NaOH (nur zur Deprotonierung); Tafelbild: oktaedrische, tetrahedrische Komplexe

… am Beispiel Phenobarbital violett + Piperidin + Co-nitrat Tetrahedraler Komplex

Murexid-Reaktion Nachweis von Purinderivaten insbesondere von Xanthinen positiver Nachweis aber auch bei Barbitursäuren und Uracilen Eindampfen der Substanz mit 10%iger H2O2-Lösung und Salzsäure bis zur Trockene (alternativ HNO3) anschließend Versetzen des Rückstandes mit Ammoniak

… am Beispiel Harnsäure Oxidation + HNO3 H2O Hydrolyse CO2 NH3

… am Beispiel Harnsäure + + H+ - H2O + NH3 rot

Chen-Kao-Reaktion Nachweis von Phenylalkylaminen mit benachbarter Amino- und Hydroxygruppe Versetzen der Substanz mit Kupfersulfat-Lösung und Natronlauge

… am Beispiel Ephedrin Etherphase: purpur beim Ausschütteln wässrige Phase: blau 2+ Cu2+ violett

Thalleiochin-Reaktion Nachweis von Chinaalkaloiden, die am Chinolin-Ring eine Sauerstoff-Funktion tragen (in Pos. 6) Versetzen der wässrigen Probelösung mit Bromwasser und verdünntem Ammoniak

… am Beispiel Chinin R Br2 OH- . Br2 .

… am Beispiel Chinin Dimerisierung - rot + + - Es entsteht eine Mischung aus diesem roten Produkt und einem blauen Radikal; deshalb geht die rote Farbe mit der Zeit in eine grüne über -

Coralyn-Reaktion empfindlicher Nachweis für Papaverin Methylengruppe darf nicht substituiert sein Erwärmen der Substanz mit Acetanhydrid und Schwefelsäure

… auf Papaverin Ac2O - HOAc gelb mit grüner Fluoreszenz + H+ - H2O + wird Coralyn zu Coralydin reduziert, so geht die Fluoreszenz verloren + H+ - H2O +