Thiol-basierte Transduktion von Redoxsignalen Andreas Meyer Heidelberger Institut für Pflanzenwissenschaften Molekulare Biologie der Pflanzen 1

Biosynthese und Funktionen von Glutathion GSSG GSH ROS NADPH + H+ NADP+ ZPred ZPox Redoxhomöostase und -signalling GR GRX GSH Biosynthese Glu Gly GSH GSH1 g-EC GSH2 Meyer et al. (2001) Plant Journal Meyer und Fricker (2002) Plant Physiology Grzam et al. (2006) FEBS Letters Grzam et al. (2007) FEBS Letters PC X GSX CysX Entgiftung und Abbau von Xenobiotika SM PCS GST PC(SM)n GGT DP Cys Meyer et al. (2001) Plant Journal Meyer und Fricker (2002) Plant Physiology Hartmann et al. (2003) Plant, Cell and Environment Cairns et al. (2006) Plant Physiology Pasternak et al. (2008) Plant Journal Maughan et al. (2010) PNAS GSH1: g-Glutamylcystein-Ligase; GSH2: Glutathion-Synthetase; PCS: Phytochelatin-Synthase; PC: Phytochelatin; SM: Schwermetall; X: Xenobiotika; GST: Glutathion-S-Transferase; GGT: g-Glutamyl-Transpeptidase; DP: Dipeptidase; GR: Glutathion-Reduktase; GRX: Glutaredoxin; ZP: Zielprotein GSH1: g-Glutamylcystein-Ligase; GSH2: Glutathion-Synthetase GSH1: g-Glutamylcystein-Ligase; GSH2: Glutathion-Synthetase; PCS: Phytochelatin-Synthase; PC: Phytochelatin; SM: Schwermetall; X: Xenobiotika; GST: Glutathion-S-Transferase; GGT: g-Glutamyl-Transpeptidase; DP: Dipeptidase;

Zellen decodieren Umweltsignale H2O Water —OH Hydroxylradical H2O2 Hydrogenperoxide O2—- Superoxide O2 Molecular Oxygen e- increasing reduction Sensor ROS Protein Protein Signal transduction cascades Metabolite TF Protein Gene Nucleus Cytosol TF: Transcription factor; ROS: Reactive Oxygen Species; TF: Transcription factor; ROS: Reactive Oxygen Species; 3 3

Thiol-basierte Redoxregulation ROS Red SH Ox S S-SG Signal- transduktion Oxidation Reduktion Redox-regulierte Thiolproteine Zielproteine Adaptive physiologische Prozesse

Das antioxidative System wirkt ROS entgegen Oxidation Zeit Entgiftung Stress Signal- transduktion Zielproteine NADPH NADP+ H2O2 2 H2O GSSG 2 GSH GR DHA 2 Ascorbat 2 MDHA APX DHAR GR: Glutathion-Reduktase; DHAR: Dehydroascorbat-Reduktase; APX: Ascorbat-Peroxidase

Thiol-basierte Transduktion von Redoxsignalen - mittelfristige Ziele - zeitlich und räumlich aufgelöste Detektion stressinduzierter Redoxsignale in vivo genetische Dissektion von Komponenten der Redoxhomöostase Untersuchung der Auswirkung induzierter Redoxänderungen auf Transkriptionsmuster

Redox-sensitive GFPs (roGFPs) ermöglichen dynamische Redoxmessungen in vivo Control + H2O2 405 nm 488 nm PI Ratio + DTT Jim Remington, Univ. Oregon Hanson et al. (2004) JBC Meyer et al. (2007) PlantJ

Zeitaufgelöste Messung des Redoxpotentials und genetische Dissektion von Redoxsignalen CLSM Flow: 4ml/min 0.5x MS 1mM H202 100mM H202 10mM DTT 0.5x MS ox 4.5 4.0 3.5 3.0 Ratio 405/488 2.5 2.0 1.5 1.0 red 0.5 10 20 30 40 50 60 Time (min) Col-0 gr1 Marty et al. (2009) PNAS

Verschiedene Quellen für H2O2 Chloroplast Peroxisom Mehler Reaktion H2O2 H2O2 H2O2 H2O2 H2O2 O2 O2–- Redox- Signalling NADPH Oxidase Elektronen- transport H2O2 Zellkern Mitochondrium

Kompartimentierung der GSH-Biosynthese Cytosol Chloroplast GSH g-EC Gly GSH2 Cys Glu GSH1 CLT CLT Maughan et al. (2010) PNAS 10

clt Mutanten sind Pathogen-sensitiv Cytosol D EGSH S NPR1 TRX NPR1 SNO WT cad2 clt1clt2clt3 Infektion mit Phytophthora brassicae, 5 dpi WT cad2 clt1clt2clt3 PR1 Expression (%) 100 75 50 25 NPR1 NPR1 TGA PR1 Nucleus NPR1: nonexpressor of PR genes 1; PR1: pathogenesis-related 1; TRX: Thioredoxin; SNO: Nitrosothiol; Maughan et al. (2010) PNAS 11

Thiol-basierte Transduktion von Redoxsignalen - langfristige Ziele - Identifizierung von GRX-Targetproteinen Untersuchung zur Funktion von Gluathionylierung als Schutz vor ROS-induzierter Überoxidation und zur Modulation von Proteinaktivitäten Entwicklung neuer Biosensoren zur Messung weiterer Redoxparameter

GRXs vermitteln den Austausch von Elektronen zwischen dem GSH Redoxpuffer und Proteinen Nicht-Stressbedingung Ziel- proteine (roGFPox) GSH ROS GRX [GSH]2 [GSSG] Stressbedingung ROS [GSH]2 [GSSG] GRX Ziel- proteine (roGFPred)

Schutz von Proteinen vor schädlicher Oxidation SH S-SG GSSG GSH GRX k2 H2O2 k1 Protein SOH k1 ~ 1 M-1 s-1 << k2 ~ 1.5x104 M-1 s-1 H2O2 2.785e4 2.790e4 2.795e4 2.800e4 2.805e4 2.810e4 2.815e4 2.820e4 2.825e4 2.830e4 Mass, amu 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 Intensity, cps 27946 Da 28252 Da D 306 Da - GRX +GRX Protein SO2H H2O2 Protein SO3H

Fusion von roGFPs mit Redoxproteinen zur Messungen verschiedener Redoxparameter NADPH NADP+ H2O2 2 H2O GSSG 2 GSH GR DHA 2 Ascorbat 2 MDHA APX DHAR Fusion mit: Meßparameter GRX EGSH Orp1 H2O2 ??? Ascorbat TRX NADPH/NADP+

Vielen Dank!