Regulation der Transkription Institut für biophysikalische Chemie Labor für Strukturanalyse Heike Pöpperl, PhD Grundlagen der Zellulären Biochemie Vorlesung zum Modul BCB P07 im Bachelor-Studiengang Biochemie Hannover Regulation der Transkription

Regulation der Transkription in Bakterien Zusammenfassung von zusammengehörigen Genen (Cistrons) und Regulationssequenzen in ein Operon. Proteine eines Stoffwechselweges oder multimere Enzyme (zB RNAP) werden gemeinsam und nach Bedarf transkribiert. Genetic Regulatory Mechanisms in the Synthesis of Proteins FRANCOIS JACOB AND JACQUES MONOD 1961 Lactose-Operon

Struktur eines Operons Shine-Dalgarno box Shine-Dalgarno box Stopp Codon TAA, TAG, TGA Stopp Codon TAA, TAG, TGA +1 ATG Cis-Regulatorische Elemente ATG DNA ORF 1 ORF 2 USE Promotor Operator 5’ UTR = Leadersequenz Spacer = 5’UTR des 2. Cistrons Terminator sequenz Cistron 1 Cistron 2 Transkriptionseinheit = Operon polycistronische mRNA 3‘ 5‘ 1 2

Regulation eines Operons Repression: Repressor/Corepressor P rep cistron 2 cistron 1 P O R 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ R 1 2 R Induktion: Repressor/Induktor P rep cistron 2 cistron 1 P O R 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ R 1 2 Aktivierung: Aktivator/Coaktivator P akt cistron 2 cistron 1 A P A 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 1 2 A 1 2 A

Lactose (lac)-Operon: basale Transkription regulierter Promotor Terminator lacA lacY lacZ mRNA β-Galactosidase β-Galactosid-Transacetylase β-Galactosid-Permease

lac-Operon: Repression regulierter Promotor Promotor lacA lacY lacZ Terminator lacI mRNA lac-Repressor β-Galactosidase β-Galactosid-Transacetylase β-Galactosid-Permease β-Galactosid-Permease β-Galactosidase

lac-Operon: Induktion regulierter Promotor lacI lacA lacY lacZ mRNA lac-Repressor lac-Repressor

Wachstum von E. coli mit Glucose und Lactose Diauxie Zellzahl Lactose Substrat-/Enzym- konzentration Glucose Beta- galactosidase Zeit Beobachtung: Glucose wird zuerst verbraucht, Lactose später Lactose-abbauendes Enzym wird erst hergstellt, nachdem die Glucose komplett verbraucht wurde

Inhibition des lac-Operons durch Glucose: Katabolitrepression Zunahme der lac-mRNA nach Induktion mit ITPG. Kultur von E. coli mit Glycerin als Kohlenstoffquelle. Glucose ist die Hauptkohlenstoffquelle von E. coli. Glucose inhibiert die Expression des lac-Operons, trotz Induktor.

Katabolitrepression des lac-Operons CAP/CRP cAMP + Glucose lacI lacA lacY lacZ mRNA mRNA mRNA lac-Repressor Für eine effiziente Transkription des lac-Operons ist CAP/CRP (Katabolit(gen)aktivatorprotein/ cAMP-Rezeptorprotein) mit gebundenem cAMP nötig. Aktivator mit Coaktivator Glucose senkt die Konzentration des Coaktivators cAMP, der Aktivator ist inaktiv, nur basale Transkription. Folge: Glucose wird zuerst verbraucht. Glucose hemmt zusätzlich die Aufnahme von Lactose, indem sie eine Hemmung der Permease bewirkt.

Proteine am Promotor des lac-Operons lac-Repressor cAMP-CAP/CRP RNAP

cAMP-CAP/CRP Bindung des Dimers In der großen Furche

Proteine am Promotor des lac-Operons lac-Repressor cAMP-CAP/CRP RNAP

Es exisitieren zwei sekundäre Operatoren im lac Operon CAP binding site -61 bp P lacI lacZ lacY lacA Lac rep. binding site (O3) -82 bp O3 ggcaGTGAGCGcAacgCAATT Lac rep. binding site (O1) +11 bp O1 AATTGTGAGCGGATAACAATT Lac rep. binding site (O2) +412 bp O2 AAaTGTGAGCGagTAACAAcc

Alle drei Operatoren werden zur vollständigen Repression benötigt 1,300 440 700 18 1.9 1.0 Repression O3 O1 O2 lacA lacY lacZ lacI lacA lacY lacZ lacI lacA lacY lacZ lacI lacA lacY lacZ lacI lacA lacY lacZ lacI lacI lacZ lacY lacA

Helix-turn-helix-Motiv lac-Repressor Helix-turn-helix-Motiv

Regulation des Tryptophan (trp)-Operons Repression 5 Polypeptide 3 Enzyme Trp-Repressor +Corepressor Chorismat g g g g g L-Tryptophan Corepressor

Regulation des Tryptophan (trp)-Operons Attenuation 5 Polypeptide 3 Enzyme

Regulation des trp-Operons Attenuation Kopplung von Transkription und Translation

Regulation durch Attenuation: Operons für Aminosäuresynthese Leaderpeptide

Transkription in Eukaryoten Komplexer als in Bakterien Escherichia coli Image Width: 9.5 microns Image Technology: SEM (Scanning Electron Microscope) Maus Vielzeller: Verschiedene Zelltypen Entwicklung Vielzellige Eukaryoten brauchen mehr Gene als einzellige Prokaryoten: Jeder Zelltyp benötigt unterschiedliche Genprodukte zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Zellen von Vielzellern interagieren in komplexer Weise mit ihrer Umgebung. Folge: Aufwendige Regulation der Genexpression. Die Regulation erfolgt vor allem bei der Initiation der Transkription.

Genomgröße und Zahl der Gene Anzahl der Gene: Mensch/Maus ca 23000 Drosophila ca 13000 Arabidopsis ca 26000 Reis ca 35000 C. elegans ca 19000 Hefe ca 6000 E. coli ca 4300 Wichtige Modellorganismen für Isolierung und biochemische Charakterisierung von eukaryotischen Transkriptionsproteinen sind Hefe und Mensch. Oft unterschiedliche Nomenklatur für homologe Proteine.

Regulation der Transkription in Eukaryoten Transkription von proteincodierenden Genen durch RNAP II Regulation der Initiation Bindung von generellen Transkriptionsfaktoren (GTFs) und RNAP II an den „core“ Promotor ist nicht ausreichend für eine effiziente Transkription. Zusätzliche DNA-Sequenzen (cis-regulatorische Sequenzen) und der Zustand des Chromatins regulieren die Genexpression. „core“ Promotor TFIID RNAP II CTD GTFs

Organisation regulatorischer DNA- Elemente eines typischen Säugergens Isolator Enhancer transkribierte Sequenzen Exon Intron Promotor Exon: Sequenz, die in der mRNA bleibt. Intron: Sequenz, die aus der prä-mRNA, herausgespleißt wird. Promotor: „core“ Promotor: Bindung von GTFs, RNAP II regulatorischer Promotor: Bindung von Transkriptionsfaktoren, Regulation der Transkription. 5‘ vom „core“ Promotor. Enhancer: Bindung von Transkriptionsfaktoren, Regulation der Transkription. Isolator: Bindung von Proteinen, die das Chromatin mit dem Kernskelett verankern. Unterteilung des Chromatins in voneinander isolierte funktionelle Bereiche

Enhancer Bereich der DNA mit Bindungsstellen für sequenzspezifische DNA-bindende Proteine (Transkriptionsfaktoren). Regulation der Transkription: aktivierend oder falls Repressoren gebunden werden: inhibierend (Silencer, negativer Enhancer) Lage: bis zu vielen Tausend Basenpaaren 5‘ oder 3‘ vom Start der Transkription oder in einem Intron. Funktion ist unabhängig von Orientierung oder Distanz zur Startstelle. Enhancer wirken unabhängig voneinander. Ihr Effekt kann sich „addieren“: verstärkte Aktivierung der Transkription oder gewebespezifische Aktivität. Beispiel: even-skipped (eve) Gen even-skipped (eve) wird im Drosophila-Embryo in sieben Streifen exprimiert. Unabhängige Enhancer regulieren die Expression in den einzelnen Streifen.

Isolatoren Bereiche der DNA, die das Chromatin in strukturelle und funktionelle Domänen unterteilen. Eine solche Domäne ist von außerhalb liegenden Einflüssen wie Enhancern oder sich ausbreitendem Heterochromatin abgeschirmt. Isolatoren enthalten Sequenzen, die von Proteinen gebunden werden, die die DNA am Kernskelett (Kernmatrix) verankern, sogenannte scaffold/matrix attachment Regionen (S/MARS).

Bindung von Transkriptionsfaktoren an Promotor und Enhancer viele Tausend Basenpaare Enhancer TF TF TF regulatorischer Promotor TF TFIID RNAP II CTD TF GTFs TF „core“ Promotor

Transkriptionsfaktoren Transkriptionsfaktoren sind sequenzspezifische DNA-bindende Proteine, die die Transkription regulieren (Bindung der RNAP/Initiation). Transkriptionsfaktoren können konstitutiv aktiv oder aktivierbar sein, zB durch Phosphorylierung oder Ligandenbindung (nukleäre Rezeptoren). Transkriptionsfaktoren erkennen Sequenzen in Promotoren und Enhancern durch mindestens eine sequenzspezifische DNA-bindende Domäne. Die sequenzspezifische Erkennung erfolgt häufig durch ein a-Helix-Motiv in der großen Furche. Weitere Domänen: Transaktivierungsdomäne Protein/Protein-Interaktionsdomäne(n) zur Bindung von Coaktivatoren oder Corepressoren.

Sequenzspezifische DNA-bindende Domänen/Motive Zinkfingermotiv Häufige Form Cys2His2-Zinkfinger . Zwei oder mehr Zinkfingermotive bilden die DNA-bindende Domäne von Zinkfinger-Transkriptionsfaktoren und binden in der großen Furche. Zn2+ wird von Cys und His koordinativ gebunden Bändermodell: antiparalleles b-Faltblatt, a-Helix Zif268: 3 Zinkfinger, jeweils Kontakt mit 3 bp. Basenspezifische Kontakte durch die a-Helix in der großen Furche.

Sequenzspezifische DNA-bindende Domänen/Motive Zinkfingermotiv der nukleären Rezeptoren (zB Steroidhormonrezeptoren) Besitzen zwei Cys2Cys2-Zinkfinger : DNA-bindende Domänen eines Glucocorticoidrezeptor-Dimers. Bindung an AGAACANNNNTGAACA Jeweils eine a-Helix der zwei Zinkfinger jeder Domäne liegt in der großen Furche In dieser Struktur macht nur die untere Domäne sequenzspezifische Kontakte.

Sequenzspezifische DNA-bindende Domänen/Motive Leucine-Zipper mit basischem Bereich, bZIP-Motiv a-helikaler Bereich mit basischer DNA-bindender Domäne und Leucine-Zipper-Dimerisierungs-Domäne: Leucin an jeder 7. Stelle, dh auf einer Seite der a-Helix. Zwei solche helikale Bereiche bilden eine Dimerisierungsoberfläche für Homo-und Heterodimere. Leucine-Zipper basischer DNA-bindender Bereich

Sequenzspezifische DNA-bindende Domänen/Motive Homeodomäne Die Homeodomäne besteht aus drei a-helikalen Bereichen, wobei die Struktur der letzten beiden Helices dem Helix-Turn-Helix-Motiv der bakteriellen Regulatorproteine ähnelt. Helix 3 liegt in der großen Furche: sequenzspezifische Kontakte. N-terminaler Teil der Homeodomäne (blau): sequenzspezifische Kontakte in der kleinen Furche. Homeodomänen kommen in vielen Transkriptionsfaktoren vor, die in der Embryonalentwicklung eine Rolle spielen. bithorax Mutation

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) Untersuchung der Bindung von Proteinen an DNA ChIP ermöglicht die Charakterisierung von Bindungssequenzen von DNA-bindenden Proteinen wie zB Transkriptionsfaktoren. ChIP erlaubt die Untersuchung von Promotoren oder Enhancern, die ein Transkriptionsfaktor in vivo, in einem bestimmten Gewebe oder in einem Entwicklungsstadium bindet. Reversible Vernetzung (crosslinking) von DNA und Proteinen: Formaldehyd führt zur kovalenten Bindung (crosslink) zwischen Amino- und Iminogruppen von Arg, His und Lys mit nahen Aminogruppen von Adenin und Cytosin. Die Vernetzung zwischen Protein und DNA kann unter sauren Bedingungen rückgängig gemacht werden.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) 1. Crosslinking von DNA und Protein in lebenden Zellen durch Formaldehyd. Zelllyse und Isolierung des Chromatins. 2. Fragmentierung (shearing) der DNA des Chromatins durch Ultraschall. Inkubation des Chromatins mit einem Antikörper gegen das gewünschte Protein. Inkubation mit ProteinA Agarose: bindet Antikörper mit gebundenem Chromatin. 3. Immunpräzipitation Durch die Agaroseperlen kann der gebundene Komplex abzentrifugiert und gereinigt werden. 4. Lösen des Crosslinks. Aufreinigung der freigesetzten DNA: Man enthält DNA-Sequenzen, an die das untersuchte Protein gebunden war. 5. Anhängen von definierten Primern und Bestimmung der DNA-Sequenz durch Sequenzierungsmethoden der neuesten Generation. Eick und Geyer Chem. Rev. 113: 8456-8490;2013

Vermittlung zwischen Transkriptionsfaktoren und RNAP II Mediator-Komplex viele Tausend Basenpaare Enhancer TF TF TF Mediator regulatorischer Promotor TF TFIID RNAP II CTD TF GTFs TF „core“ Promotor Cohesin

Mediator Komplex aus ca 26 Untereinheiten (UE) in Metazoen, ca 21 UE in Hefe. Manche UE bilden austauschbare Module. Der Mediator ist wichtig für die Transkription von RNAP II-transkribierten Genen. Der Mediator bindet an die unphosphorylierte C-terminale Domäne (CTD) der Rpb1 UE der RNAP II. Der Mediator agiert als Coaktivator der Transkription, indem er unter anderem als Vermittler zwischen Transkriptionsfaktoren und RNAP II fungiert. Komplex aus Mediator und RNAP II (Hefe) nach EM-Struktur EM-Strukturen des Mediators. Gegeneinander bewegliche Bereiche sind farbig markiert.

Regulation der Genexpression durch Chromatin Grobe Unterteilung des Chromatins aufgrund von Färbeeigenschaften: Heterochromatin: weitgehend inaktiv Allgemeine Merkmale: wenig H3 Lys4 Methylierung (H3K4Me), häufige H3 Lys9 Methylierung (im Menschen: H3K9Me3), wenig Histonacetylierung, DNA Methylierung an CpG; stärker kondensiert. Constitutives Heterochromatin: Centromer und Telomere (Chromosomenenden), meist repetitive Sequenzen Fakultatives Heterochromatin: gewebespezifisches Muster Euchromatin: aktiv oder aktivierbar Die Chromatinstruktur ist für DNA-bindende Proteine zugänglich und wird experimentell etwa10 Mal besser von DNAse I gespalten als Heterochromatin.

Organisation des Chromatins

Coreglatoren regulatorischer Promotor „core“ Promotor Enhancer TF TF viele Tausend Basenpaare Enhancer TF TF TF Co-Regulatoren Mediator regulatorischer Promotor TF TFIID RNAP II CTD TF GTFs TF „core“ Promotor

Coregulatoren der Transkription Proteine, die nicht sequenzspezifisch an DNA binden, sondern von Transkriptionsfaktoren rekrutiert werden, um die Transkription zu aktivieren (Coaktivatoren) oder zu inhibieren (Corepressoren). Viele Coregulatoren modifizieren Chromatin oder binden chromatinmodifizierende Enzyme Kovalente Modifikationen von Histonen ATP-abhängige Änderungen der Chromatinstruktur (remodeling)

Kovalente Modifikation von Histonen Histon-Acetyltransferasen (HATs): Coaktivatoren Acetylierung der positiv-geladenen Aminogruppe an Lysinseitenketten. Folge: Negative Ladung der DNA wird weniger gut kompensiert und die Verpackung der DNA wird aufgelockert. Eine Acetylierung ermöglicht die Bindung von Proteinen zB über eine Bromodomäne. HAT-Aktivität kann Teil eines größeren Komplexes, wie SAGA oder dem PCAF-Komplex sein. Histon-Deacetylasen (HDACs) Corepressoren Deacetylieren Lysin.

Kovalente Modifikation von Histonen Histon-Methyltransferasen (HMTs): Corepressoren oder Coaktivatoren Methylierung von Lysin- und Argininseitenketten der Histone H3 und H4. S-Adenosylmethionin (SAM) als Methyldonor. Kann zur Abschaltung von Genen durch Bildung von Heterochromatin führen. Proteine mit Chromodomäne erkennen methylierte Histone. Lysin-Demethylasen und Arginin-Demethylasen Demethylierung. Bei der Demethylierung von methyliertem Arginin entsteht Citrullin.

für ein transkribiertes Gen des Menschen „Histoncode“ für ein transkribiertes Gen des Menschen aktiv/ aktivierbar Taf3-Bindung H3K9me3 Heterochromatin H3K27me3 inaktives Gen Histon mit alternativem H2A Protein

Modifikation der Chromatinstruktur ATP-abhängige Änderungen der Chromatinstruktur (remodelling) durch Remodelling-Komplexe Bewirken Entfernung oder Austausch von Histonproteinen, Verschiebung von Histonoctameren oder Translokation von Histonoctameren auf einen anderen DNA-Strang. Resultat: DNA wird für Transkriptionsfaktoren zugänglich und für RNAP II passierbar Beispiel: SWI/SNF-Komplex in Hefe

Gewebespezifität der Genexpression, der Transkriptionsfaktoren,, der Euchromatin-und Heterochromatin-bereiche……. …….entsteht während der embryonalen und fötalen Entwicklung . Mausentwicklung Kathy K Niakan et al.;Nature Protocols 8, 1028–1041 (2013)

Zusammenfassung: Regulation der Transkription (Initiation) in Eukaryoten Regulation auf mehreren Ebenen ATP-abhängige Änderungen der Chromatinstruktur und kovalente Histonmodifikationen ermöglichen die Bindung von Proteinen an DNA RNAP II bindet über generelle Transkriptionsfaktoren an den „core“-Promotor Eine effiziente Transkription erfordert die zusätzliche Aktivierung durch Transkriptionsfaktoren, die in Promotornähe oder an Enhancer binden, und Coregulatoren. Der Mediator-Komplex vermittelt zwischen Transkriptionsfaktoren und dem Präinitiationskomplex/RNAP II