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20.. Ingo Rechenberg Zwischen Bionik und Biotechnologie Wie baut man einen Biosensor ? PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung Bionik II ( Biosensorik / Bioinformatik)

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1 20.

2 Ingo Rechenberg Zwischen Bionik und Biotechnologie Wie baut man einen Biosensor ? PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung Bionik II ( Biosensorik / Bioinformatik)

3 Biotechnologie versus Bionik

4 Lotus Effekt Superhydrophob Cassie-Baxter-Effekt

5 Biotechnologie Bionik versus Lotusblatt-Zellkultur Erkundung des Effekts Synthetisches Produkt Biologisches Produkt

6 Photobiologische Wasserstoffproduktion

7 Biotechnologie Bionik versus Blaualge Nostoc muscorum Unter sehr speziellen Bedingungen Kein Stickstoff! Fehlreaktion. Wasserstoff wird freigesetzt. Kohlendioxid = Container für Wasserstoff

8 Konstruktion eines Schallschnelle-Vektormessgeräts Partikel Geschwindigkeit

9 Biotechnologie Bionik versus Technische Schaltung

10 Der bionische Ansatz zur Realisation einer künstlichen Nase

11 AC = Adenylcyclase cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat Vorbild Biologie: Verstärkung durch eine Enzymkaskade Duftstoff

12 Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft 1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor 2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein 3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC) 4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP 5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an 6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen 7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal

13 Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt 2. Es entsteht Metarhodopsin 3. Metarhodopsin aktiviert Transducin 4. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE) 5. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP 6. Dadurch schließen sich Na-Kanäle 7. Es kommt zu einer Hyperpolarisation 8. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV Molekulare Verstärkung:

14 Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !

15 "Katalyse ist die Beschleunigung eines langsam verlaufenden chemischen Vorgangs durch die Gegenwart eines fremden Stoffes" (1894). "Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im Endprodukt einer chemischen Reaktion zu erscheinen, ihre Geschwindigkeit verändert. (1901)" Wilhelm Ostwald Wilhelm Ostwald ( )

16 Einmolekülmessung durch Synthese einer Katalysatorkaskade Rezeptor Signalmolekül Katalysator y n t h e s e S y n t h e s e S Abstraktes Modell:

17 „Einen Naturvorgang verstehen heißt, ihn in Mechanik zu übersetzen“ Herrmann von Helmholtz

18 Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade

19 oder Mechanisches Modell eines Moleküls, das in eine andere Form umgewandelt wird ( z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin )

20 Mechanisches Enzym Wird frei, um ein weiteres Modellmolekül zu verwinkeln

21 · · · 1000

22 Soll jetzt ein Enzym sein

23 · · ·

24 > > Schmetterlingsmoleküle

25 An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten Das sieht dann so aus:

26 Extreme Empfindlichkeit Selektivität auf biologische Stoffe Was zeichnet den Biosensor aus ? Extreme Empfindlichkeit

27 Der geschichtlich erste Biosensor, der die Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte Der Glukose-Biosensor

28 Messlösung Platinanode Elektronik Immobilisiertes Enzym Membran Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor ? Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt Text Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode

29 Schema eines Biosensors Molekulare oder Nano-Formerkennung

30 Funktionsprinzip eines Biosensors Analytlösung Selektor (Rezeptor) Effekt Transducer Elektrode Thermistor Piezokristall Verstärker Chemische Substanz Temperatur Licht Masse Elektrisches Potenzial E l e k t r i s c h e s S i g n a l Nano-Formerkennung

31 In Biosensoren benutzte Immobilisierungsmethoden Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix Kovalente atomare Bindung des Enzyms Enzym in semipermeabler Membran-Hülle Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms Enzym Technisches Substrat Enzym- Vernetzung Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen

32 Magensäure Kann Eiweiß spalten. Kann noch kein Eiweiß spalten ! Pepsinogen: Pepsin: Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym Beim Pepsinogen steckt der grüne „Proteinschlüssel“ noch nicht im großen Molekülknäuel. Das Enzym ist inaktiv! Bei Anwesenheit von Magensäure wird der grüne Schlüssel eingesteckt und so das Enzym aufgeschlossen. Pepsinogen wird zum Eiweiß spaltenden Pepsin.

33 Immobilisiertes Magensäure Messung des Eiweiß-Spaltprodukts Eiweißspaltung Pepsinogen Pepsin Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym

34 Funktionsprinzip eines Biosensors Analytlösung Selektor (Rezeptor) Effekt Transducer Elektrode Thermistor Piezokristall Verstärker Chemische Substanz Temperatur Licht Masse Elektrisches Potenzial E l e k t r i s c h e s S i g n a l Nano-Formerkennung

35 Mögliche technische Messaufnehmer für einen Glukose-Biosensor Zum Glukosesensor

36 Glukose-Sensor heute Thermodynamik MikrogravimetriePhotometrie Elektrochemie Transducer Kalorimetrie Mechanik Optik Potenziometrie Amperometrie Konduktometrie Temperaturmessung Wägung Lumineszenz-, Farb-Messung Voltammetrie Potenzialdifferenz bei Strom Null Strom bei konstanter Spannung Strom mit Spannungsänderung Widerstands/ Leitfähigkeitsmessung Zur Elektrochemie Volt- und Amperometrie

37 N ERNST sche Gleichung Semipermeable Membran A gA g A gA g e-e- e-e- e-e- U = Spannung R = Gaskonstante T = Absolute Temperatur F = Faraday-Konstante z = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronen c = Elektrolytkonzentration U NO 3 c ox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels c red = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie Hoch konzentrierte Silbernitratlösung Niedrig konzentrierte Silbernitratlösung Ag + Zur Elektrochemie AgNO 3

38 Weitere Beispiele für Biosensoren

39 Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede- nen Pflanzen aufspüren. Foto: Forschungszentrum Jülich Biosensor für Knoblauch

40 Foto: Forschungszentrum Jülich Biosensor für Zyanid Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an. Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei- sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän- derung registriert.

41 Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment Durch eine kleine Öffnung des Containments stehen das Enzym und die Elektrode mit der Messlösung in Kontakt. Moleküle der Messlösung können in die Enzymmatrix hineindiffundieren, welche bei Anwesenheit des Analyten H 2 O 2 erzeugt. Dieses wird an der Platinelektrode elektrochemisch umgesetzt. Zum Glukosesensor

42 Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)

43 Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt. Kupfer IsolatorenHalbleiter Metalle Kunststoffe Glas Glimmer Diamant Quarz Selen Germanium Silizium Silber Eisen Leitfähigkeit 1  m

44 Silizium Bor Phosphor p-dotiert n-dotiert Fähigkeit der Elektronenleitung und Löcherleitung im dotierten Halbleiter

45 n-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Phosphor p-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Aluminium Ein noch besseres Schema

46 Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken Zur Menge des Dotierungsstoffs im Halbleiter

47 + Sperrschicht Durchlass + Bewegung der Elektronen Bewegung der Löcher Bewegung der Elektronen Bewegung der Löcher Mit Elektronen und „Löchern“ verarmte Schicht Mit Elektronen und „Löchern“ angereicherte Schicht Der Minuspol "presst" Elektronen in die n-Schicht, der Pluspol der Stromquelle saugt Elektronen aus der Sperrschicht ab.

48 MOSFET Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span- nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt. Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor

49 MOSFET Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke. Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.

50 CHEMFET BIOFET Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf. Hier findet eine Enzymreaktion statt Zur Glucoseoxidase-Gluconolactonase-Reaktion

51 Vergleich Na + -Tore / BIOFET Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!

52 Bei der klassischen Elektronenröhre verhält sich das Steuergitter wie die Membran einer Sinnes- zelle, deren Durchlässigkeit enzymatisch kontrolliert wird.

53 Extreme Empfindlichkeit Selektivität auf biologische Stoffe Was zeichnet den heutigen Biosensor aus ? Extreme Empfindlichkeit Es fehlt das Kaskadenprinzip !

54 Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode Glukose: Amperometrischer Biosensor Harnstoff: Potentiometrischer Biosensor Amperometrischer Biosensor Lactat: Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay Piezoelektrizität ImmunoassayCandida albicans: Cholesterin: Amperometrischer Biosensor Penicillin: Ionenselektive Glas-Elektrode Natrium: Potentiometrischer Biosensor Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-Sensor pH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik

55 Zyanid-Biosensor Formaldehyd-Biosensor Enzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3 Anthrax-Biosensor Harnstoff-Biosensor Enzym Urease Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak Enzym ??? Enzyme für Biosensoren

56 Ende

57 Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. C LARK und C. L YONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach C LARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.

58 Messlösung Elektrode Elektronik Immobilisiertes Enzym Membran Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt

59 Messlösung Elektrode Elektronik Immobilisiertes Enzym Membran Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt

60 Glucose O Glucose- oxidase + Gluconolacton + O 2 H 2 O H kcal Glucono- lactonase Gluconsäure H + + MOSFET


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