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Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 1 Pflanzliche Symbiosen Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken Herbstsemester 2009 Freitag,

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Präsentation zum Thema: "Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 1 Pflanzliche Symbiosen Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken Herbstsemester 2009 Freitag,"—  Präsentation transkript:

1 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 1 Pflanzliche Symbiosen Thomas Boller, Andres Wiemken und Vreni Wiemken Herbstsemester 2009 Freitag, 14-18, alternierend mit "Geobotanik" (Christian Körner) Gesamttitel

2 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene Bakterien als Pathogene Titelblatt

3 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 3 Mutualistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Knöllchen-Symbiose der Leguminosen (Fabaceae) Bilder aus dem WWW Knöllchen-Symbiose

4 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 4 Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle) Bilder aus Schopfer und Brennicke, 1999 Agrobacterium (Schopfer)

5 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 5 Vielfalt der Bakterienkrankheiten Skript – p. 2

6 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 6 Pseudomonas phaseolicola Pseudomonas phaseolicola auf Bohnen Bild aus dem WWW

7 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 7 Clavibacter michiganense Clavibacter michiganense auf Tomaten Bild aus dem WWW

8 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 8 Xanthomonas campestris Xanthomonas campestris auf Kohl Bild aus dem WWW

9 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 9 Xanthomonas vesicatoria Xanthomonas vesicatoria auf Tomate Bild aus dem WWW

10 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 10 Titel Feuerbrand Feuerbrand: eine gefährliche bakterielle Krankheit für Obstbäume

11 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 11 Feuerbrand: Erreger Erwinia amylovora, ein Bakterium (von Bienen übertragen) Feuerbrand 1 Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

12 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 12 Vermehrungszyklus des Feuerbrandes Feuerbrand 1 Skript p. 3; Bilder aus dem WWW

13 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 13 Feuerbrand 2 Feuerbrand: Symptome beim Apfel Bilder aus dem WWW

14 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 14 Feuerbrand Karte Feuerbrand: Quarantäne-Massnahmen Skript – p. 3

15 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 15 Feuerbrand: Befallskarte im Kanton Zürich im Jahr 2002 Feuerbrand Kt Zürich Skript p. 3; Bild aus dem WWW

16 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 16 Cotoneaster Friedhof Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand Bild aus der Berner Zeitung

17 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 17 Cotoneaster befallene Pflanze Cotoneaster, eine wichtige Wirtspflanze für Feuerbrand Bild aus dem WWW

18 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 18 Massnahmen gegen Feuerbrand "Beliebte Pflanze macht Ärger" Cotoneaster z.B. in Friedhöfen, Gärten, Anlagen Seit 1. Januar 2003 ist das In-Verkehr-Bringen und Vermehren sämtlicher Cotoneaster Arten in der ganzen Schweiz verboten! Feuerbrand-Bekämpfung: Entfernung von Cotoneaster Bild aus dem WWW

19 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 19 Titel Agrobacterium Agrobacterium tumefaciens und "Genetic engineering" in der Natur

20 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 20 Antagonistische Symbiose Bakterien-Pflanzen: Agrobacterium tumefaciens (Erreger der Wurzelhalsgalle) Agrobacterium (Schopfer) Skript p. 4

21 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 21 Agrobacterium und "genetic engineering" in der Natur Agrobacterium Transformation T-DNA: in Bakterium nicht "exprimiert" T-DNA: in Pflanze "exprimiert" T-DNA - Transfer Wundsignal Induktion des DNA- Transfers Skript p. 4

22 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 22 Agrobacterium: das Ti-Plasmid Agrobacterium: Ti-Plasmid Tumor-Gene 1,2: Auxin-Synthese Tumor-Gen 3: Cytokinin-Synthese Octopin-Synthese und-Transport Skript p. 5

23 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 23 Agrobacterium: Octopin Agrobacterium Octopin Skript p. 5

24 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 24 Erwinia chrysanthemi - Titel Erwinia carotovora und Erwinia chrysanthemi: Pectolytische Enzyme als Angriffswaffen (Pathogenizitätsfaktoren bzw. Virulenzfaktoren)

25 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 25 Erwinia carotovora auf Karotte Erwinia_carotovora_Karotte

26 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 26 Erwinia carotovora auf Salat Erwinia_carotovora_Salat

27 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 27 Erwinia carotovora auf Chicorino Erwinia_carotovora_Chicorino

28 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 28 Erwinia carotovora auf Kartoffel Erwinia_carotovora_Kartoffel

29 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 29 Erwinia carotovora auf Radieschen Erwinia_carotovora_Kartoffel

30 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 30 Angriffswaffen von Bakterien

31 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 31 Angriff eines Weichfäule-Bakteriums (Erwinia sp.) Erwinia_carotovora_Radies Bakterien "mazerieren" das Gewebe! (Auflösung der Mittellamelle aus Pectin) Skript p. 6

32 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 32 Struktur von Pectin; pectolytische Enzyme Polygalacturonsäure (Pectin) Hydrolase: Pectinase Lyase: Pectolyase + H 2 O Skript p. 6

33 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 33 Klassische Fragestellung der (molekularen) Phytopathologie Pathogenitätsfaktor/ Virulenzfaktor "Ist ein gegebenes Molekül (Enzym, Toxin etc.) kausal für die Krankheit wichtig?" Ist es ein Pathogenitätsfaktor? Ist es ein Virulenzfaktor? Ist es ein (unwichtiges) Begleitprodukt? Pathogenitätsfaktoren sind qualitativ wichtig: Krankheit ja oder nein... Virulenzfaktoren sind quantitativ wichtig: stärkere oder geringere Symptome Skript p. 7

34 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 34 Klassische Fragestellung der Pathologie Kochsche Postulate "Ist ein gegebener Mikroorganismus kausal für die Krankheit wichtig?" Der Mikroorganismus muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein. Der Mikroorganismus muss in Reinkultur isoliert werden können. Der isolierte Mikroorganismus muss die Krankheits- symptome auslösen Koch'sche Postulate Skript p. 7

35 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 35 Robert Koch, der Entdecker des Tuberkulose-Erregers Robert Koch 1843Robert Koch wird in Clausthal (Harz) geboren. Er wächst gemeinsam mit zehn Geschwistern auf. 1866Abschluß seines vierjährigen Medizinstudiums in Göttingen Tätigkeit als praktischer Arzt 1876Bei Versuchen zur Entstehungsgeschichte der gefürchteten Tierseuche Milzbrand weist Koch erstmals spezifische Krankheitserreger als Krankheitsursache nach. Bisher führte man diese Krankheit auf "Miasmen", d.h. die Luft verunreinigende Gifte, zurück. Publikation der Versuchsergebnisse in "Beiträge zur Biologie der Pflanzen". 1881Koch gelingt der Nachweis des Tuberkulose-Bakteriums 1884Er entwickelt mit den "Kochschen Postulaten" eine Definition bakteriologischer Erregernachweise, die in abgewandelter Form bis heute Gültigkeit hat. 1885Berufung zum Professor an der Berliner Universität Wiederholte Forschungsreisen in die Tropen. Er untersucht Entstehung und Ausbreitung der Pest, der Malaria, der Schlafkrankheit und der Rinderpest. 1905Nobelpreis für Medizin. 1910Koch stirbt in Baden-Baden Bild aus dem WWW

36 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 36 Robert Koch auf einer seiner Expeditionen Robert Koch, Expedition Bild aus dem WWW

37 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 37 Die Koch'schen Postulate (publiziert 1884) Kochsche Postulate... so müssen sich jene drei Postulate erfüllen lassen, deren Erfüllung für den stricten Beweis der parasitären Natur einer jeden derartigen Krankheit unumgänglich nothwendig ist: 1.) Es müssen constant in den lokal erkrankten Partien Organismen in typischer Anordnung nachgewiesen werden. 2.) Die Organismen, welchen nach ihrem Verhalten zu den erkrankten Theilen eine Bedeutung für das Zustandekommen dieser Veränderung beizulegen wäre, müssen isolirt und rein gezüchtet werden. 3.) Mit den Reinculturen muss die Krankheit experimentell wieder erzeugt werden können. Skript p. 7

38 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 38 Entsprechendes Vorgehen für molekulare Studien Molekulare Version Kochsche Postulate "Ist ein gegebenes Molekül kausal für die Krankheit wichtig?" Das Molekül muss stetig im kranken Gewebe vorhanden sein. Das Molekül muss isoliert und gereinigt werden können. Das isolierte Molekül muss die Krankheitssymptome auslösen. Mutanten des Krankheitserregers, die das Molekül nicht bilden, müssen avirulent sein. Skript p. 7

39 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 39 Beispiel: Pectolytische Enzyme von Erwinia chrysanthemi Beispiel: pectolytische Enzyme "Sind die pectolytischen Enzyme kausal für die Krankheit wichtig?" Enthält das kranke Gewebe pectolytische Enzyme? Können pectolytische Enzyme isoliert werden? Lösen isolierte pectolytische Enzyme die Krankheits- symptome aus? Ja! Aber: Erwinia chrysanthemi besitzt mehrere verschiedene pecto- lytische Enzyme! Welche davon sind Virulenz-/bzw. Pathogenitäts- faktoren? Skript p. 7

40 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 40 Alan Collmer (Cornell University, Ithaca, New York) Alan Collmer

41 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 41 Jagd auf pectolytische Enzyme Bakterium wird auf Medien mit Pectin gezüchtet (Pectin als C-Quelle). Pectolytische Enzyme werden isoliert, gereinigt, charak- terisiert, ansequenziert. Gene für die entsprechenden Proteine werden identi- fiziert, kloniert. Sechs verschiedene pectolytische Enzyme identifiziert und deren Gene kloniert: pehX, pelX, pelA, pelB, pelC und pel E! Skript p. 7

42 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 42 Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte Funktionstest Klonierte Gene werden in Escherichia coli exprimiert (Laborstamm, der kein Pectin spalten kann). Transgene Escherichia coli werden auf Pectin-Platten ausplattiert. Kolonien, welche pectolytische Enzyme produzieren, machen "Löcher" in die Platte. Alle sechs Gene liefern funktionelle Enzyme! Skript p. 7

43 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 43 Funktioneller Nachweis der Aktivität der Genprodukte Pectinagar-Test JOURNAL OF BACTERIOLOGY 179 (8): APR 1997

44 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 44 Knock-out der entsprechenden Gene in E. chrysanthemi Knock-out Mutanten Homologe Rekombination ("Marker-Austausch") mit Hilfe eines DNA-Stücks, das aussen Homologie zum Ziel-Gen aufweist und im Zentrum einen "Resistenz-Marker". Mutierte Stämme werden mit Hilfe des "Resistenz- Markers" selektioniert; Mutationen werden kombiniert Der sechsfach mutierte Stamm sollte keine "Löcher" mehr in Pectin-Platten machen. Grosse Überraschung: Der sechsfach mutierte Stamm ist auf Chrysanthemen-Blattstücken immer noch pathogen!! Stimmt! Skript p. 8 Wie geht es jetzt weiter?

45 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 45 Suche nach weiteren pectolytischen Enzymen! Abstract Kelemu/Collmer 93 Skript p. 8

46 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 46 Schlussfolgerung Die neu entdeckten Enzyme kommen im kranken Gewebe vor! Die neu entdeckten Enzyme können isoliert werden! Die isolierten Enzyme verursachen die Krankheits- symptome (Mazerierung des Gewebes)! Wie geht es jetzt weiter? Die Koch'schen Postulate sind erfüllt! Skript p. 8

47 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 47 Angriffswaffen von Bakterien Abwehrkräfte der Pflanzen

48 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 48 Review Innate Immunity "Erkennung": Flagellin-Erkennung und "innate immunity" Skript p. 9

49 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 49 Review Innate Immunity "Innate immunity" bei Tieren und Pflanzen Skript p. 9

50 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 50 Review Innate Immunity Ablauf der Immun-Abwehr bei PFlanzen Skript p. 9

51 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 51 Titel Zipfel Nature 428, , 2004 Skript p. 10

52 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 52 Zipfel Fig. 1a Fig. 1a: Bakterien-Wachstum in Pflanzen, die mit flg22 vorbehandelt wurden Zipfel et al., Nature 428, , 2004 Dieses Experiment zeigt auch, dass es bei Infiltration keinen Unterschied in der Anfälligkeit von Wildtyp und fls2 gibt... Skript p. 11

53 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 53 Zipfel Fig. 3a Fig. 3a: Krankheits-Anfälligkeit bei Sprüh-Inokulation Zipfel et al., Nature 428, , aber bei Sprüh-Inokulation sind die fls2 Mutanten deutlich empfindlicher! Skript p. 11

54 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 54 Zipfel Fig. 3b Fig. 3b: Bakterielles Wachstum nach Sprüh-Inokulation Zipfel et al., Nature 428, , 2004 Skript p. 11

55 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 55 Zipfel Fig. 3c Fig. 3c: Ökotyp Ws-0 (eine natürliche fls2 Mutante) wird durch Transformation mit dem FLS2-Gen resistenter! Zipfel et al., Nature 428, , 2004 Skript p. 11

56 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 56 Die flg22-induzierte Resistenz ist auch in Mutanten aktiv! Skript p. 11

57 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 57 Zipfel Fig. 2 Fig. 2: Es muss noch weitere MAMPs geben! Zipfel et al., Nature 428, , 2004 Skript p. 11

58 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 58 Angriffswaffen von Bakterien Hrp-Gene und das "Wettrüsten" zwischen Bakterien und Pflanzen

59 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 59 Entdeckung von Hrp-Genen Entdeckung von hrp-Genen Interessante Beobachtung: Bestimmte Mutationen bei phytopathogenen Bakterien (Beispiel: Pseudomonas syringae) führen: 1) zum Verlust der Fähigkeit, in der inkompatiblen Inter- aktion eine "Hypersensitive Reaktion" (HR) auszulösen, und gleichzeitig 2) zum Verlust der Pathogenität in der kompatiblen Interaktion. Die entsprechenden Gene wurden hrp genannt. Skript p. 12

60 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 60 Der "Hrp gene cluster" Hrp-Gen-Cluster Skript p. 12 Mehrere Transkripte und viele Proteine für den gleichen "Injektionsapparat"! Transkripte/Proteine im Genom anders gruppiert, dienen dem gleichen Zweck ("Injektionsapparat")

61 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 61 Bakterielle Sekretionssysteme z.B. pectolytische Enzyme z.B. Proteasen "Effektor-Proteine" "Injektions -Kanüle" Skript p. 12 T-DNA!

62 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 62 Vergleich von Pflanzen und Tieren (I) Vergleich Pflanzen/Tiere I Skript p. 13 Effektor-Proteine fördern Endocytose! Effektor-Proteine unterdrücken Abwehr!

63 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 63 Vergleich von Pflanzen und Tieren (II) Vergleich Pflanzen/Tiere II Skript p. 13

64 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 64 Induktion und Funktion der "Effektor-Proteine" Induktion und Funktion Effektor-Proteine Induktion von hrp- und Effektor- Genen "Normaler" Wirt: Effektor-Proteine schwächen Abwehr: Resultat Krankheit Wirt mit Resistenzgen: Effektor-Proteine werden "erkannt": Resultat HR, keine Krankheit Skript p. 14 R >30 "xop"-Gene für "Effektor-Proteine"!

65 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 65 Zusammenfassung zur Funktion der "Effektorproteine" Schlussfolgerung Die Effektorproteine sind Virulenzfaktoren, welche u.a. die allgemeine Abwehrbereitschaft der Pflanze reduzieren. Wenn die Pflanze aber ein Resistenzgen gegen ein gegebenes Effektorprotein besitzt, wird dieses ein Avirulenzfaktor und löst eine HR aus. Doppelnatur der Effektorproteine: HR - P... Nicht im Skript!

66 Pflanzliche Symbiosen HS 2009: Bakterien als Pathogene - 66 "Effektorproteine", AVR-Faktoren und Co-Evolution Schlussfolgerung Schritt 1: Pflanze "erkennt" Bakterium (z.B. via Flagellin) Schritt 2: Bakterium unterdrückt Erkennung via Effektor A Schritt 3: Pflanze "erkennt" Effektor A Schritt 4: Bakterium unterdrückt Erkennung via Effektor B Schritt 5: Pflanze "erkennt" Effektor B Evolution Stärke der Abwehr Skript p. 14


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