Chemotaxis von Eukaryonten. Chemotaxis in Dictyostelium Discoideum The dictyostelids are a group of cellular slime moulds. When food (normally bacteria)

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1 Chemotaxis von Eukaryonten

2 Chemotaxis in Dictyostelium Discoideum The dictyostelids are a group of cellular slime moulds. When food (normally bacteria) is readily available they take the form of individual amoebae, which feed and divide normally. However, when the food supply is exhausted, they aggregate to form a multicellular assembly, called a pseudoplasmodium or slug (not to be confused with slug the animal). The slug has a definite anterior and posterior, responds to light and temperature gradients, and has the ability to migrate. Under the correct circumstances the slug matures forming a fruiting body with a stalk supporting one or more balls of spores. These spores are inactive cells protected by resistant cell walls, and become new amoebae once food is available. In Acytostelium, the fruiting body is supported by a stalk composed of cellulose, but in other dictyostelids the stalk is composed of cells, sometimes taking up the majority of the original amoebae. With a few exceptions, these cells die during stalk formation, and there is a definite correspondence between parts of the slug and parts of the fruiting body. Aggregation of amoebae generally takes place in converging streams. The amoebae move using filose pseudopods, and are attracted to chemicals produced by other amoebae. In Dictyostelium, aggregation is signalled by cAMP, but others use different chemicals. Dictyostelium has been used as a model organism in molecular biology and genetics, and is studied as an example of cell communication, differentiation, and programmed cell death. From: en.Wikipedia.org

3 Der Schleimpilz Dictyostelium Discoideum

4 Entwicklungszyklus von D. Discoideum Hungerphase II Wachstumsphase I Differenzierungs- phase III

5 Der Lebenszyklus von Didi Phase I: Die Amöben leben (auf Agarplatten) unter paradiesischen Bedingungen (gutes Vehältnis Nahrung zu Populationsdichte) als Einzeller und vermehren sich durch Teilung. Diese Phase besteht aus zwei Teilen: Einem Bereich exponentiellen Wachstums und einem stationären Zustand mit konstanter Zellzahl. Phase II: Erschöpfung des Nahrungsvorrats führt nach acht Stunden zu einer kollektiven Wanderung der Zellen zu statistisch verteilten Zentren aufgrund von kollektiver Chemotaxis. Wir werden unten sehen, daß dies die Folge einer Steuerung der Zellen durch die Signalsubstanz c-AMP ist. Phase III: Differenzierung der Zellen und Aufbau eines Schleimpilzes. Drei Typen von Zellen entstehen: Teilungsfähige Sporenzellen, stabilisierende Stielzellen und Hüllenzellen des Sporenkopfes.

6 Chemotaxis in Dictyostelium Discoideum

7 Dicties bewegen sich zufällig ohne c-AMP Stimulation

8 Eukaryotische Chemotaxis Richtungsdetektion (directional sensing) - Lokale Anregung-globale Inhibition Polarisation (polarization) - Lipidvermittelte Signalübertragung Fortbewegung (locomotion) - Aktinpolymerisation

9 Formen der Signalübertragung

10 Der Signalstoff c-AMP 1) c-AMP : die Signalsubstanz 2) ATP : fungiert als Energielieferant und als Substrat für die c-AMP–Produktion 3)Adenylatzyklase : Enzym, das ATP in c-AMP transformiert 4)c-AMP–Phosphodiesterase : ein Enzym, das c-AMP abbaut Zyklisches Adenosinmonophosphat

11 Gerichtete Dicties-Bewegung durch einen c-AMP Gradienten

12 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren leiten ihr Signal intrazellulär über trimere G-Proteine weiter, die wiederum die Konzentration intrazelluläre Mediatoren (Botenmoleküle second messenger) verändern.

13 Rezeptoraktivierung koppelt an die Adenylylcyclase Bild (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren)

14 Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) Dictyostelium cells accumulate a high-affinity cell surface cAMP receptor (CAR1) that is a member of the G protein –linked family of receptors. When CAR1 binds cAMP, the signal is transduced via a G-protein to activation of adenylyl cyclase (ACA), the membrane-associated enzyme that catalyzes the formation of cAMP from ATP. Some fraction of this cAMP is then secreted into the environment, while the rest remains within the cell. Binding of external cAMP to CAR1 thus initiates a positive feedback loop in which external cAMP binding CAR1 activates ACA, leading to the production of more external cAMP.

15 Zell-Aggregation durch c-AMP Stimulus Aggregation of D. discoideum ameobae towards cAMP, lower magnification. From R. Firtel, University of California, San Diego

16 Chemotaxis to cAMP is part of a program of differentiation where free-living amoebae aggregate to form a multicellular organism. During aggregation the cells orient and migrate directionally toward selforganizing gradients of extracellular cAMP. Studies of these events in D. discoideum have led to the identification and localization of key molecules in chemotactic signaling pathways and to the basic mechanisms involved in chemotaxis. For instance, the discovery of a family of receptors, designated cAR1–cAR4, for the chemoattractant cAMP provided the first evidence that chemotactic signaling occurs through seven helix receptors linked to heterotrimeric G proteins. The cARs couple to a specific G protein consisting of 2, one of eleven subunits, and a unique complex. A similar system operates in mammalian leukocytes, where twenty chemokine receptors couple principally to the inhibitory G protein, Gi. Additional elements of the pathway are also conserved: exposure of amoebae or leukocytes to chemoattractants results in increases in multiple second messengers, including PIs (phosphoinositides), cAMP, cGMP, IP3, and Ca2, and subsequent rearrangements in the cytoskeleton. Dictyostlium Discoideum as Model System for Chemotaxis

17 Modular view of the chemoattractant-induced signaling pathway in Dictyostelium Peter N. Devreotes et al. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. 20:22

18 G Signalübertragungsweg dictyostelium discoideum PIP 2 PIP 3 CRAC cAMP PI3K* PH PTEN Rac/Cdc42 Polarisation - Actin polymerization RAS Gradient Sensing pleckstrin homology domain + Acetylcholin- Aktivierung

19 Peter N. Devreotes et al. Developmental Cell, Vol. 3, 469–478, October, 2002, Imaging of PI3K and PTEN

20 Inositol Phospholipid Signalübertragung PIP 3 ist als Produkt der PI3 Kinase ein Botenmolekül wie cAMP. Im Unterschied zu cAMP ist PIP 3 in der Memban lokalisiert und aktiviert weitere Signal-Proteine an der Membranoberfläche durch Bindung an die Pleckstrin-Homologie-Domäne. PH Domäne PI3 Kinase

21 PIP 3 acts as internal compass Cells expressing PH-Crac- GFP sense a gradient of cAMP released from a micropipette. Work by Devreotes et al.

22 Quantitative Image Analysis (Molecular Biology of the Cell, 16, 676–688 (2005) Tian Jin et.al. )

23 Die Inositol Phospholipid Signalübertragung PIPPIP 2 PIP 3

24 Die Inositol Phospholipid Signalübertragung Gradient Sensing The ability to sense and respond to shallow gradients of extracellular signals is remarkably similar in Dictyostelium discoideum amoebae and mammalian leukocytes. Chemoattractant receptors and G proteins are fairly evenly distributed along the cell surface. Receptor occupancy generates local excitatory and global inhibitory processes that balance to control the chemotactic response. Uniform stimuli transiently recruit PI3Ks to, and release PTEN from, the plasma membrane, while gradients of chemoattractant cause the two enzymes to bind to the membrane at the front and back of the cell, respectively. Counteracting signals from the upstream elements of the pathway converge to regulate the key enzymes of PI metabolism, localize these lipids, and direct pseudopod formation.

25 Regulation der Aktin Polarisation

26 PIP 3 dynamics: temporal and gradient Temporal Signal of PH-CRAC-GFP PH-CRAC-GFP in a cAMP gradient dictybase.org Kinetic analysis of the translocation from the cytoplasm to the plasma membrane of GFP-tagged CRAC (Cytosolic Regulator of Adenylyl Cyclase-a PH domain containing protein) in response to a uniform increase in chemoattractant concentration. Frames were taken every 2 seconds. The chemoattractant was added just before the cell goes out of focus. From C.A. Parent and P.N. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions. Confocal image of GFP-tagged CRAC in living amoebae undergoing chemotaxis. CRAC-GFP specifically translocates to the leading edge of newly elicited pseudopods. The chemoattractant gradient is established using a micropipet located near the upper right corner of the frame. Images were captured every 5 seconds. From C.A. Parent and P.N. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions.

27 Actin Polymerisation an der Front

28 Polarisation Formveränderung durch Aktivierung des Zytoskletts Review by Weiner

29 Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) Negative feedback comes from PKA, inhibiting CAR1. However this positive feedback does not continue unabated. Two to three minutes after the stimulation of cells with external cAMP and the activation of ACA, there is a rapid 5- to 10-fold reduction in the affinity of CAR1 to cAMP and a consequent reduction in ACA activity. CAR1 returns to its original unphosphorylated and high-affinity state shortly after the removal of external cAMP, indicating that the phosphates are rapidly removed by a phosphatase. When cAMP is removed, the modification of CAR1 is reversed, and CAR1 is again able to bind cAMP with high affinity. Thus, ligand binding oscillates in response to the levels of external cAMP.

30 Modelle zur Erklärung von Chemotaxis Local excitation global inhibition

31 Die chemotaktische Polarisation ist persistent from Parent et al.

32 Lokale Aktivierung-Globale Unterdrückung Drei-Zustandsmodell von Rappel et al. (2002) Die Inhibierung wird durch cGMP vermittelt Die Membran kann die Zustände Q (quiescent), I (inhibited) und A (activated) annehmen.

33 An- und Aus-Schalten der c-AMP Stimulation

34 Diffusionsgleichungen Modellierung der intrazellulären Botenstoffverteilung LineareRatengleichungen Randbedingungen =Zustandsdichten c=conc.(cAMP) g=conc.(cGMP) q: quiescent, a: activated, i: inhibited

35 Num. Lösung der Diffusionsgleichungen

36 Simulationsergebnisse

37

38 Zellbeweglichkeit ist durch Aktin getrieben © Firtel Protrusion Adhesion Retraction Three steps of locomotion:

39 Eucaryotic Chemotaxis : localized response to chemoattractant Figures : Firtel Gerisch

40 Cell Aggregation Time-lapse video of small group of aggregating cells. Interval between movement steps is 6 minute. From P. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions.

41 c-AMP Waves in Aggregating Cells Core of a spiral wave in aggregating D. discoideum cells. Time between images is 10 seconds. From F. Siegert and C. J. Weijer, J. Cell Sci. 93, 325-335 (1989).

42 Video Zellaggregation

43 Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998) a rapid positive feedback activation of CAR1, via ACA, followed by a delayed negative feedback inhibition of CAR1, via PKA, produces the observed oscillations in Dictyostelium cells developed for 4 h.

44 Dark field waves of D. discoideum cells on caffeine agar. Time between images is 36 seconds. From F. Siegert and C. J. Weijer, J. Cell Sci. 93, 325-335 (1989).

45 Autokatalytische Oszillatoren

46 Der Van der Pol Oszillator Van-der-Pol Gleichung Ein äquivalentes Gleichungssystem in Normalform ist: Klassisches Modell eines autokatalytischen Oszillators mit (t)= (x 2 -1).

47 Lösungen der Van der Pol Gleichung Das System verhält sich als selbsterregender Oszillator x x x y

48 Die allosterische Kontrolle der Enzymaktivität (S) S Die über die allosterische Steuerung der c-AMP Produktion (Rezeptor- Adenylatzyklase-Komplex) eingeführte Funktion (P ex,S) führt zu einer starken Rückkopplung des c-AMP auf seine Reproduktion. (siehe z.B. Prigogine and Nicholis Ch14.3, Fig.14.3 P ex L = k1 / k2 L ist die sogenannte allosterische Konstante und ist gleich dem Verhältnis der Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation k1 und der Assoziation k2 des Effektors:

49 Wiederholung

50 Modell nach Goldbeter&Segel S : Substrat P in : Produkt innen P ex : Produkt aussen (1) (2) (3) Der Rezeptor – Adenylat Komplex wird als allosterisches Enzym modelliert mit nicht-linearer Kooperativität (P ex,S) v: Zufluß von Substrat (ATP) : Maß für die Aktivität des Enzyms k t : Translokationsrate h: Verdünnungsfaktor KP, KS sind Gleichgewichtskonstanten; und zwar ist KP die Dissoziationskonstante des c-AMP–Rezeptor–Komplexes und KS die Michaelis-Menton-Konstante (KS = [ES] / [E] [S]) des Systems ATP–Adenylatzyklase.

51 Näherung der Goldbeter Gleichung = K S / K P h k Wie bei selektiven Rezeptor-Hormon-Bindungen üblich, ist die Dissoziations­konstante KP sehr klein. Üblicherweise ist K P 10 -9 Mol/Liter. Dagegen ist K S (= Maß für die Substratkonzentration (S), bei der die Hälfte der Bindungsstellen besetzt ist) viel größer; typischerweise K S 10 -4 Mol/Liter. Daher variiert der intrazelluläre c-AMP–Spiegel sehr langsam und

52 Lösungen des Goldbeter Models Stationäre Lösungen: dS/dt=0 dP ex /dt=0 Fixpunkt: Trajektorie (a): Einmalige Erregung, das System kehrt zum Fixpunkt (Ruhezustand) zurück. Liegt der Arbeitspunkt im instabilen Bereich zwischen A und D (neg. Steigung) treten selbsterregte Oszillationen auf. A B

53 Beobachtung : Spontane c-AMP Oszillationen Die optische Dichte homogenisierte Zellsuspensionen von Dictyostelium zeigt eine kollektive Veränderung der Zellen an, die mit dem Ausstoß von c-AMP verbunden ist. [G. Gerisch und B.Hess, 1973] Ständig gerührte Zellsuspensionen (t>6h) benehmen sich als autonome Oszillatoren und senden mit einer Periode von acht Minuten c-AMP– Signale aus. Auf den Empfang eines c-AMP– Impulses antwortet die Zelle nach einer Verzögerung von ein bis zwei Minuten mit der Aussendung eines 100-fach verstärkten c-AMP–Impulses.

54 Time-lapse video of monolayer of aggregating cells filmed through a dark-field macroscope. White bands represent chemotactically oriented cells. Period of wave initiation is 6 minutes. From P. Devreotes, Johns Hopkins Medical Institutions

55 Biochemisches Netzwerk der Zellaggregation (Laub&Loomis, 1998)

56 Wahl der kinetischen Konstanten und Simulationsergebnisse gemessen geschätzt

57 Einfluss eines c-AMP Pulses auf die Phase Zugabe von c-AMP (schwarzer Peak) hat praktisch keinen Effekt auf die Phase in der ACA- Hochphase. In beiden Fällen wurde der c-AMP Zuwachs schnell durch die Phosphodiesterase abgebaut. Zugabe von c-AMP (schwarzer Peak) in einer Niedrigphase von ACA und internem c-AMP läßt den Zyklus um fast eine halbe Periode vorwärtsspringen. Das Netzwerk führt zur Synchronisierung der Zellen.

58 Phase Shift by adding cAMP SimulationExperiment (Laub&Loomis, 1998) Phase at which cAMP was added Adding cAMP to an oscillating cell leads to no change if done at zero phase shift, but either delays the cell or advances the cell in ist cycle. As result, the cells synchronize within maximally 1h. Phase at which cAMP was added

59 Phase Shift synchronizes cell populations Uncoupled by external cAMPCoupled by external cAMP (Laub&Loomis, 1998) Synchronization in the computer model. If external cAMP does not mix between cells (hypothetical control case), cells do not synchronize. But even two cells which oscillate at maximal phase difference, start to synchronize within 1h.

60 Robustheit des biochemischen Netzwerks Die Frequenz der Oszillation hängt nur schwach von der Veränderung der kinetischen Konstanten ab. Zugabe von c-AMP (schwarzer Peak) hat praktisch keinen Effekt auf die Phase wurde schnell durch die Phosphodiesterase abgebaut.... It has been argued that any biologically significant circuit that has survived selective surveillance must be robust in the face of random perturbations, and our circuit supports such an hypothesis (Barkai and Leibler, 1997)....

61 Die zyklische Phosphorylierung der Kinase ERK2 Phospho-ERK2 läßt sich durch spezifische Phospho-ERK2-Antikörper mit Hife von Western Blot nachweisen. (Maeda et al. Science 2004)

62 Simulation der Aggregatbildung Zeitserie von 3000 Zellen: Die c-AMP Konzentration ist durch Grauton angedeutet und läßt eine Spirale erkennen. E und (F) sind Seitenansichten von © und (D). In (D) sind alle Zellen in einem Aggregat versammelt und rotieren um die Längsachse. von T. Brettschneider, 1997

63 Die Theorie zellulärer Automaten Gekoppelte Felder mit jeweils einen von drei Zuständen : 0: Erholungsphase, 1: Ruhephase, 2: Angeregter Zustand Ein diskretes Reaktions-Diffusions-System Die Regeln : Start mit zufälliger Anfangskonfiguration 0 1; 2 0; 1 1, wenn kein Nachbar in angeregtem Zustand 1 2, wenn mindestens ein Nachbar angeregt

64 Simulationsergebnis einer einfachen Dynamik

65 Computermodell der Zellbewegung In einem 3-D Medium werden in jedem Voxel (i,j,k) die extrazelluläre c-AMP Konzentration (i,j,k)und die Anzahl Zellen N(i,j,k) betrachtet: Die Veränderung der extrazelluläre c-AMP Konzentration folgt einer Reaktions-Diffusionsgleichung und hängt von der Zelldichte N(i,j,k) und der zeitabhängigen intrazellulären c-AMP Konzentration ab: Die Beschreibung der Bewegung der Zellen enthält drei Komponenten: 1) Chemotaxis v c =k grad 2) Zufallsbewegung 3) Bewegung auf Grund eines Zelldrucks bei zu großer Zelldichte

66 Simulation der Aggregatbildung Zeitserie von 3000 Zellen: Die c-AMP Konzentration ist durch Grauton angedeutet und läßt eine Spirale erkennen. E und (F) sind Seitenansichten von © und (D). In (D) sind alle Zellen in einem Aggregat versammelt und rotieren um die Längsachse. von T. Brettschneider, 1997