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12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V12 Stochastische Simulation zellulärer Signalprozesse Traditionelle numerische Ansätze für chemische/biochemische.

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1 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge1 V12 Stochastische Simulation zellulärer Signalprozesse Traditionelle numerische Ansätze für chemische/biochemische Kinetik: (a) beginne mit einem Satz von gekoppelten gewöhnlichen Differentialgleichungen (für die Reaktionsraten), die die zeitliche Entwicklung der Konzentrationen der beteiligten chemischen Stoffe angeben, (b) verwende einen geeigneten Integrationsalgorithmus um, basierend auf den Ratenkonstanten und einem Satz von Anfangsbedingungen, die Konzentrationen als Funktion der Zeit zu berechnen Erfolgreiche Anwendungen : für den Hefe Zellzyklus, metabolic engineering, Modelle der gesamten metabolischen Pfade (E-cell),... Großes Problem: zelluläre Prozesse laufen in sehr kleinen Volumina ab und es ist oft nur eine sehr kleine Anzahl an Molekülen beteiligt. z.B. Interagieren bei der Genexpression einige wenige Transkriptionsfaktor- moleküle mit einer einzigen Gen-regulatorischen Region. E.coli Zellen enthalten nur etwa 10 Moleküle des Lac Repressors.

2 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge2 berücksichtige stochastische Effekte (Konsequenz1) die Modellierung der Reaktionen als kontinuierliche Flüsse von Substanzen ist nicht mehr korrekt. (Konsequenz2) Es können erhebliche stochastische Fluktuationen auftreten. Für die Untersuchung der stochastischen Effekte bei biochemischen Reaktionen werden stochastische Beschreibungen der chemischen Kinetik sowie Monte Carlo Computersimulationen benutzt. Daniel Gillespie (J Comput Phys 22, 403 (1976); J Chem Phys 81, 2340 (1977)) introduced the exact Dynamic Monte Carlo (DMC) method that connects the traditional chemical kinetics and stochastic approaches. Assuming that the system is well mixed, the rate constants appearing in these two methods are related.

3 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge3 Dynamic Monte Carlo In the usual implementation of DMC for kinetic simulations, each reaction is considered as an event and each event has an associated probability of occurring. The probability P(E i ) that a certain chemical reaction E i takes place in a given time interval t is proportional to an effective rate constant k and to the number of chemical species that can take part in that event. E.g. the probability of the first-order reaction X Y + Z would be k 1 N x with N x :number of species X, and k 1 : rate constant of the reaction Similarly, the probability of the reverse second-order reaction Y + Z X would be k 2 N Y N Z. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, (2001)

4 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge4 Dynamic Monte Carlo As the method is a probabilistic approach based on events, reactions included in the DMC simulations do not have to be solely chemical reactions. Any process that can be associated with a probability can be included as an event in the DMC simulations. E.g. a substrate attaching to a solid surface can initiate a series of chemical reactions. One can split the modelling into the physical events of substrate arrival, of attaching the substrate, followed by the chemical reaction steps. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, (2001)

5 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge5 Basic outline of the direct method of Gillespie (Step i) generate a list of the components/species and define the initial distribution at time t = 0. (Step ii) generate a list of possible events E i (chemical reactions as well as physical processes). (Step iii) using the current component/species distribution, prepare a probability table P(E i ) of all the events that can take place. Compute the total probability P(E i ) : probability of event E i. (Step iv) Pick two random numbers r 1 and r 2 [0...1] to decide which event E will occur next and the amount of time by which E occurs later since the most recent event. Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, (2001)

6 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge6 Basic outline of the direct method of Gillespie Using the random number r 1 and the probability table, the event E is determined by finding the event that satisfies the relation Resat et al., J.Phys.Chem. B 105, (2001) The second random number r 2 is used to obtain the amount of time between the reactions As the total probability of the events changes in time, the time step between occurring steps varies. Steps (iii) and (iv) are repeated at each step of the simulation. The necessary number of runs depends on the inherent noise of the system and on the desired statistical accuracy.

7 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge7 Bacterial Photosynthesis 101 Photons Light Harvesting Complexes light energy electronic excitation Reaction Center e – –H + –pairs ATPase chemical energy cytochrome bc 1 complex H + gradient; transmembrane potential ubiquinon cytochrome c 2 electron carriers outside inside

8 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge8 Modelling as metabolic network Chemical reactions involved:

9 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge9 Photosynthesis – cycle view light energy electronic excitation e – –H + –pairs chemical energy H + gradient, transmembrane voltage outside inside The conversion chain: stoichiometries must match turnovers! electrons 2 cycles: protons

10 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge10 LH1 / LH2 / RC im Lehrbuch Photonen einfangen Hu et al, 1998 B800, B850, Car. LH2: 8 αβ Dimere LH1: 16 αβ Dimere downhill Transport der Exzitonen LH2 LH1 RC

11 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge11 Der Cytochrom bc 1 Komplex die Protonenpumpe" Bekannte X-ray Structuren Berry, etal, 2004 bezeichnen stets einen Dimer. Q-Zyklus: 2H + pro 1e –

12 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge12 The F o F 1 -ATP synthase I at the end of the chain: producing ATP from the H+ gradient Capaldi, Aggeler, 2002 per turn: 10–14 H + 3 ATP 1 ATP 4 H +

13 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge13 The electron carriers Cytochrome c: electrons from bc 1 to RC heme in a hydrophilic protein shell 3.3 nm diameter Ubiquinon UQ10: carries electron–proton pairs from RC to bc 1 hydrophobic tail long (2.4 nm) isoprenoid tail taken from Stryer

14 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge14 Tubular membranes – photosynthetic vesicles where are the bc 1 complexes and the ATPase? Jungas et al., nm LH1 RC bc1? * 50 nm 100 nm Bahatyrova et al., 2004 no bc 1 found!

15 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge15 Chromatophore vesicle: typical form in Rh. sphaeroides Lipid vesicles 30–60 nm diameter H + and cyt c inside Vesicles are really small! average chromatophore vesicle, 45 nm Ø: surface 6300 nm²

16 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge16 Photon capture rate of LHCs + Bchl extinction coeff. normalization ( Bchl = 2.3 Å 2 ) relative absorption spectrum of LH1/RC and LH2 sun's spectrum at ground (total: 1 kW/m²) multiply capture rate: 0.1 γ s kW Bchl typical growth condition: 18 W/m² LH1: 16 * 3 Bchl 14 γ/s LH2: 10 * 3 Bchl 10 γ/s Cogdell etal, 2003 Feniouk et al, 2002 Franke, Amesz, 1995 Wavelength [nm] dE/dλ [arb.] Gerthsen, 1985

17 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge17 LH1 / LH2 / RC native Siebert etal, 2004 electron micrograph and density map 125 * 195 ², γ = 106° Area per: per vesicle (45 nm) LH1 monomer (hexagonal) 146 nm² LH1 dimer234 nm² LH2 monomer37 nm² LH LH2456 nm²11 Chromatophore vesicle, 45 nm Ø: surface 6300 nm²

18 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge18 Photon processing rate at the RC Which process limits the RCs turnover? Unbinding of the quinol 25 ms Milano et al binding, charge transfer 50 ms per quinol (estimate) with 2e - H + pairs per quinol 40–50 γ/s per RC 22 QH 2 /s 1 RC can serve 1 LH1 + 3 LH2 = 44 γ/s LH LH2 456 nm² 11 LH1 dimers including 22 RCs on one vesicle 480 Q/s can be 18 W/m² per vesicle

19 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge19 The F 1 F 0 -ATP synthase "…mushroom like structures observed in AFM images…" ATPase is "visible" 1 ATPase per vesicle Feniouk et al, 2002 Gräber et al, 1991, 1999 limited throughput of the ATPase "Arrhenius" "binding" per turn: 10–14 H + per 3 ATP 1 ATP 4 H + ATPase fromATP/sH + /s chloroblasts< E. coli<100400

20 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge20 How much bc 1 ? measured enzymatic activity per bc 1 dimer: 84 cyt c are reduced / s 400 H + / s per ATPase 1 dimer can process 42 QH / s 1 dimer "pumps" 168 H + / s 11 bc 1 dimers per vesicle can be loaded by RCs proton generation by 2.4 bc 1 dimers per vesicle enough to drive 1 ATPase x5 !!! inout safety first! number of bc 1 complexes should be limited by how many protons can be pumped out by ATPase Xiao et al. 2000

21 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge21 bc 1 Placement Diffusional limits? Roundtrip times maximal capacity of the carriers: T = T RC + T bc1 + T Dîff Cytochrome c : T RC 1 msT bc1 12 msT Diff 3 μs T round-trip = 13 ms 3 cyt c per vesicle sufficient to carry e - s available: 22 cyt c per vesicle Quinol: T RC 50 msT bc1 23 msT Diff 1 ms T round-trip = 75 ms 7 Q per vesicle sufficient to carry e - s. available: 100 Q per vesicle Diffusion is not limiting poses no constraints for the position of bc 1

22 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge22 Proposed setup of a chromatophore vesicle blue: small LH2 rings (blue) blue/red: Z-shaped LH1/RC dimers form a linear array around the equator of the vesicle, determining the vesicles diameter by their intrinsic curvature. At the poles green/red: the ATPase light blue: the bc1 complexes Increased proton density close to the ATPase. favors close placing ATPase and bc 1 complexes. yellow arrows: diffusion of the protons out of the vesicle via the ATPase and to the RCs and bc1s. Geyer, Helms, Biophys. J. (2006) 91, 921

23 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge23 reconstituted LH1 dimers in planar lipid membranes Upper panel: drawn after the AFM images of Scheuring et al (4) of LH1 dimers reconstituted into planar lipid membranes. The Z-shaped dimers are seen from their cytoplasmic side. The average height of the membrane is indicated in the upper panel by the grey level of the background. Scheuring et al measured the distances between the minima of the AFM height scan to be 38.5 nm and the distance be tween the lowest and the highest parts to be 3.8 nm. Lower panel: interpretation how alternatingly oriented LH1 dimers may explain the observed height scan indicated by the dashed lines. These values are nicely reproduced by the proposed arrangement of the LH1 dimers, when one assumes that they are stiff enough to retain the bending angle of 26 that they would have on a spherical vesicle of 45 nm diameter and taking into account the length of a single LH1 dimer of about 19.5 nm.

24 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge24 Photosynthese: Lehrbuch-Darstellung

25 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge25 Darstellung des photosynthetischen Apparats als Fließband Dicke Pfeile : Pfad, durch den die Photonenenergie in chemische Energie umgewandelt wird, die in ATP gespeichert wird. Abgerundete Rechtecke kennzeichnen Zwischenzustände. Jede Umwandlung findet in parallel arbeitenden Proteinen statt. Ihre Anzahl N mal der Konversionsrate eines einzelnen Proteins R bestimmt den gesamten Durchsatz dieses Schritts. : eintreffende Photonen, die in den LHCs aufgefangen werden. E : Exzitonen in den LHCs und in den RCs e H + Elektronen–Protonen –Paare, die auf den Quinonen gespeichert werden. e sind die Elektronen auf den Cytochrom c 2 pH : Protonengradient über die Membran H + : Protonen außerhalb des Vesikels

26 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge26 Modellierung interner Prozesse am Reaktionszentrum Die Summe aller Einzelreaktionen mit ihren individuellen Raten k bestimmt die gesamte Umsatzrate R RC eines einzelnen RC. Dicke Pfeile : Energiefluss von den Exzitonen durch die kreisförmigen Änder- ungen der Ladungszustände des special pair Bchl (P) im RC. Abgerundete Rechtecke : Reservoirs.

27 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge27 Parameter

28 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge28 Stochastische Dynamiksimulationen II Produktionsläufe fester Parametersatz Integriere Ratengleichungen mit: - Gillespie-Algorithmus (Assoziationen) - Timer-Algorithmus (Reaktionen); 1 Zufallszahl bestimmt, wann die Reaktion stattfindet.

29 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge29 Beispiel: Bindung und e - Transfer am Reaktionszentrum

30 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge30 Stochastische Simulationen eines kompletten Vesikels Modellvesikel:12 LH1/RC-Monomere 1-6 bc 1 Komplexe 1 ATPase 120 Quinone 20 Cytochrom c 2 Integrationszeitschritt: 10 s Eine Minute Realzeit zu simulieren benötigt 1,5 Minuten auf einem Opteron 2.4 GHz Prozessor.

31 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge31 Simuliere einen Anstieg der Lichtintensität Erhöhe Lichtintensität langsam während 1 Minute von 0 auf 10 W/m 2 (Quasi-Gleichgewicht) Es gibt zwei Regimes - eines wird durch das verfügbare Licht begrenzt - eines durch den Durchsatz der bc 1 Geringe Lichtintensität: Linearer Anstieg der ATP-Produktion mit der Lichtintensität Hohe Lichtintensität: Sättigkeit wird desto später erreicht umso größer die Anzahl an bc1 Komplexen Geyer, Lauck, Helms, J. Biotech (im Druck)

32 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge32 Oxidationszustand des Cytochrom c 2 Pools geringe Lichtintensität: alle 20 Cytochrom c 2 werden durch bc 1 reduziert hohe Lichtintensität: RCs sind schneller als die bc 1, die c 2 s warten auf Elektronen

33 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge33 Oxidationszustand des Cytochrom c 2 Pools mehr bc 1 Komplexe können mehr Cytochrom c 2 beladen.

34 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge34 Gesamtzahl an produziertem ATP Geringe Lichtintensität: jede Unterbrechung stoppt ATP-Produktion Hohe Lichtintensität: Unterbrechungen bis 0.3 s Dauer werden abgepuffert. Blaue Linie: Beleuchtung

35 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge35 c 2 Pool wirkt als Puffer Bei hoher Lichtintensität ist der c2 Pool vorwiegend oxidiert. Wenn das Licht abgedreht wird, arbeitet bc1 weiter (c2s beladen, Protonen pumpen, ATPase zur Produktion von ATP antreiben) bis der c2 Pool vollkommen reduziert ist.

36 12. Vorlesung WS 2006/07Softwarewerkzeuge36 Zusammenfassung Chromatophoren-Vesikel sind ein ideales Modellsystem um molekulare Simulationen und Differentialgleichungsmodelle zu verknüpfen. Obwohl einige Parameter immer noch nicht experimentell bekannt sind, kann mit dem bekannten Wissen ein detailliertes kinetisches und räumliches Modell erstellt werden. Mit solchen Systemen kann man testen, wieviel Wissen über ein System erforderlich ist um es komplett simulieren zu können. Vorhersagen müssen durch neue Experimente getestet werden! Solche Tests sind unbedingt nötig bevor man ein Modell als korrekt bezeichnen kann.

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