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学生 : 袁 秋 华 学生 : 袁 秋 华 导师 : 顾蕴洁教授 导师 : 顾蕴洁教授 王 忠教授 王 忠教授 小麦 Rubisco 单克隆 抗体的制备.

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1 学生 : 袁 秋 华 学生 : 袁 秋 华 导师 : 顾蕴洁教授 导师 : 顾蕴洁教授 王 忠教授 王 忠教授 小麦 Rubisco 单克隆 抗体的制备

2  Rubisco 首先由 Wildman 和 Bonner 于 1947 年从菠菜 叶中作为一种可溶性大分子蛋白质被发现,当时称 为 “ 分部 I 蛋白( fraction I protein” )。后来碳同 化研究发现分部 I 蛋白就是催化光合作用中 co 2 固定 的 RuBp 羧化酶。  1971 年发现 RuBp 羧化酶是一个双功能酶,它还能 催化 RuBp 的氧化作用。此后该酶就被称为核酮糖 二磷酸羧化酶 / 加氧酶,简称 Rubisco 。 Rubisco 的发 现

3 Rubisco 的结构 所有真核和大多数原核的光合有机体中的 Rubisco 由 8 个大亚基和 8 个小亚基组成,大亚基一般由 475 个氨基酸 残基组成,不同来源的 Rubisco 大亚基序列有 80% 以上的 同源性,而且特别是在 169—220 和 321—340 之间的氨基 酸残基序列,在不同有机体中几乎完全一致,现在已知 这些区域含有与催化及活化过程有关的氨基酸残基。 大多数 Rubisco 小亚基由 123 个氨基酸残基组成,不同 植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大亚基低得多,一 般在 70% 左右,然而,小亚基序列中有两个区域非常保 守,即残基 10—21 和 61—67 ,暗示这些部分可能有什么 重要功能。

4 Rubisco 的结构图

5 核酮糖 -1 , 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶(简称 Rubisco )催 化卡尔文循环中最初的 CO 2 固定,使核酮糖 -1 , 5- 二磷酸 ( RuBp )与 CO 2 形成两分子 3- 磷酸甘油酸。该酶也同时 催化光呼吸作用中的第一个步骤,使 RuBp 与 O 2 反应产生 一分子磷酸甘油酸和一分子磷酸乙醇酸。因此 Rubisco 处 于光合碳还原和光合碳氧化两个方向相反但又相互连锁 的循环的交叉点上,它对净光合速率起着决定性的影响。 Rubisco 的功 能

6 Rubisco 的纯化

7 Rubisco 的纯度鉴定 利用 ND-PAGE 和 SDS-PAGE 鉴定 Rubisco 纯度。

8 Rubisco 的纯度鉴定结果 Rubisco 的非解离聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 Rubisco 的 SDS- 聚丙 烯酰胺凝胶电泳结果 大亚基 小亚基 Rubisco 标准蛋白 分子量 ( ×1000 )

9 我们得到高纯度的 Rubisco 后,就 可以制备其单克隆抗体了,下面 先跟大家介绍一下单克隆抗体制 备的技术。

10 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性 结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并 采集抗血清的方法产生的,因而抗血清通常含有针对其 他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗 原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体 也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针 对同一抗原决定簇的常规血清抗体,仍是由不同 B 细胞 克隆产生的异质的抗体组成。因而,常规血清抗体又称 多克隆抗体( polyclonal antibody ),简称多抗。由于 常规抗体的多克隆性质,加之不同批次的抗体制剂质量 差异很大,使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。 因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限 量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着 杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现。 单克隆抗体产生的背景

11 1975 年, Kohler 和 Milstein 大胆地把丧失合成次黄嘌呤 - 鸟嘌呤磷酸 核糖转移酶( hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase , HGPRT )的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融 合。融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄嘌呤 ( hypoxanthine , H )、氨基喋呤( aminopterin , A )和胸腺嘧啶 核苷( thymidine , T )的培养基( HAT )中生长进行选择。在融合 后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是 HGPRT+ ,但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合 的 HGPRT- 骨髓瘤细胞和相互融合的 HGPRT- 骨髓瘤细胞不能在 HAT 培养基中存活,只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因 得到分别来自亲本脾细胞的 HGPRT 和亲本骨髓瘤细胞的连续继代 特性,而在 HAT 培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的 那样,最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞 系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤。生长杂 交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体。 单抗制备的原理

12 单克隆抗体概念 1975 年, Kohler 和 Milstein 建立了淋巴细胞杂交瘤 技术,他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体 外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成 B 细胞 杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征,既像 骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永 生不死,又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗 体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆 系,即杂交瘤细胞系,它所产生的抗体是针对同一抗 原决定簇的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体 ( monoclonal antibody ),简称单抗。

13 单抗与多抗的比较 优点缺点 单抗 针对单一抗原 纯度高 专一性强 重复性好 能持续地无限量体外繁殖 获得高效价的单抗往往需要 耗费较多的人力物力与时间, 因此其价格也较高, 适应性窄 多抗 识别的适应性宽, 制备价格相对较低 针对多个抗原 纯度不高 专一性不强 重复性较好 每次都要从动物血清中提取

14 杂交瘤细胞的筛选 方法: 方法: 1 、免疫酶技术 2 、免疫荧光技术 2 、免疫荧光技术 3 、间接血凝试验 3 、间接血凝试验 4 、放射免疫测定 4 、放射免疫测定 免疫酶技术是将抗原抗体反 应的特异性和酶对底物显色 反应的高效催化作用有机结 合而成的免疫学技术。由于 它特异性高,灵敏度高,现 已广泛用于筛选和鉴定单抗。 间接血凝试验又称被动血凝 试验( PHA ),是目前应用 较广的检测方法之一。本试 验是以包被可溶性抗原的红 细胞作为指示系统,当被检 抗体与包被在红细胞上的抗 原产生特异性反应时,导致 红细胞凝集现象。可见,该 法具有灵敏、快速、容易操 作和无需昂贵仪器等优点, 而且经改用醛化红细胞以后, 克服原来重复性差的缺点。 放射免疫测定是用放射性同 位素标记抗原或抗体,以检 测相应抗原或抗体的定量方 法。在筛选和鉴定单抗时常 用抗原固相法,即用抗原包 被聚乙烯微板,借以检测样 品中的 McAb

15 包 被 洗 涤 封 闭 洗 涤 加一抗 用碳酸盐 Buffer 将两酶抗原稀 释到所需浓度,每孔加入 100μL , 4 ℃包被过夜。 每孔加入保温液 200μL , 37 ℃ 孵育 3h (或 4 ℃过夜)。 每孔加入经稀释液稀释的待 测抗血清样品 100μL ,同时设 立阴性对照, 37 ℃孵育 2h 。 单抗检测 (间接 ELISA ) 用 PBST 洗涤 3 次,每次洗 浸泡 5 分钟后拍干。

16 结果判定 洗 涤 终 止 显 色 洗 涤 加 二 抗加 二 抗 每孔加入稀释至工 作浓度的羊抗鼠 IgG 二抗 100μL , 37 ℃孵育 2h 。 每孔加入 OPD 底 物溶液 100μL , 37 ℃避光反应 15min 左右。 在 490nm 波长下测定样 品的 OD 值,结果以 P / N 比值表示,即将样品 的 OD 值与阴性样品 OD 值的均值相比,若大于 1.5 倍,即判为阳性。 用 2mol/L 的硫酸 溶液终止。

17 杂交瘤细胞的克隆化 a 、制备小鼠腹腔细胞。同 “ 细胞融合 ” 一节 中的方法。 b 、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含 20% 血清的 HT 培养基稀释至每毫升含 2.5 、 15 和 50 个细胞 3 中不同的稀释度。 c 、按每毫升加入 5×104-1×105 细胞的比例, 在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬 细胞。 d 、每种杂交瘤细胞分装 96 孔板一块,每个 稀释度 32 孔,每孔量为 0.2ml ,每孔的杂交瘤 细胞数分别为 0.5 、 3 和 10 。 e 、 37 ℃、 7.5% CO2 湿润培养 7-10 天,出现 肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微 镜下观察,标出只有单个克隆生长的孔,取 上清作抗体检测。 f 、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养,并 冻存。 ( 1 )有限稀释法 ( 2 )软琼脂法 a 、在培养皿中制备饲养细胞(小鼠腹腔细胞) 单层。 b 、临用前将 2.0% 琼脂糖生理盐水溶液与等 量双倍浓度的 HT 培养基混匀,配成 1% 琼脂 糖培养液, 45 ℃水浴中温育。 c 、吸去平皿上层培养液,加入 1% 琼脂糖培 养液 3ml ,室温 10 分钟。 d 、取杂交瘤细胞悬液 1ml ,加入 1% 琼脂糖培 养液 1ml 混匀,铺于上层。 e 、 37 ℃、 7.5% 湿润培养 7-14 天;克隆生长至 2mm 时,用毛细吸管吸出克隆,直接转种于 含有饲养细胞的 24 孔板,扩大培养。 f 、吸取上清,检测抗体,阳性孔可继续克隆 化,或扩大培养、冻存。

18 单抗的大规模制备 ( 1 )动物体内生产单抗 ( 3 )杂交瘤细胞的无血清培养 ( 2 )体外培养生产单抗

19 谢谢!


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