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1 Lipid rafts und ihre Funktion in biologischen Membranen Seminar Biotechnologie 1 Lisa Marie Finkler SS 2012 Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt.

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1 1 Lipid rafts und ihre Funktion in biologischen Membranen Seminar Biotechnologie 1 Lisa Marie Finkler SS 2012 Betreuer: Prof. Dr. I. Bernhardt

2 2 Gliederung Biologische Membranen  Aufbau Membranlipide Membranproteine  Funktionen einer biologischen Membran  Fluid Mosaic Modell Lipid Rafts  Funktionen von Lipid Rafts Ergebnisdarstellung  „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“  “Ca++-dependent viscle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin”

3 3 Biologische Membranen Grenze zwischen 2 Kompartimenten  Intrazellulär (innerhalb einer Zelle)  Interzellulär (Inneren einer Zelle zu Zellaußenraum) Selektiv permeabel Bestehen hauptsächlich aus:  LipidenAnteil ist je nach Membrantyp  Proteinenunterschiedlich

4 4 Aufbau einer biologischen Membran [1]

5 5 Aufbau einer biologischen Membran Membranlipide bilden die Grundstruktur (Doppelschicht) Amphiphatisch  Hydrophiler Kopf  Lipophiler Kohlenwasserstoffrest Permeabilitätsschranke Phospholipide Sphingolipide Cholesterin MizelleLipiddoppelschicht Liposom [2]

6 6 Aufbau einer biologischen Membran Phospholipide  Phosphatidylcholin (siehe Abbildung)  Phosphatidylserin  Phosphatidylethanolamin  Phosphatidylinositol häufigste Membranlipide [3]

7 7 Aufbau einer biologischen Membran Sphingolipide „Signalübertragung, Interaktion zwischen einzelnen Zellen, Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Zelltod“ [6] [4]

8 8 Aufbau einer biologischen Membran Cholesterin  Steroid-Grundgerüst  Hydrophiler Anteil (OH-Gruppe)  Membranoberfläche  Hydrophober Rest  Innerhalb der Membran Gehalt an Cholesterin beeinflusst die Fluidität der Membran [5]

9 9 Aufbau einer biologischen Membran Membranproteine Integrale Membranproteine (1-3) Periphere Membranproteine (4) Lipidverankerte Proteine (5) [6]

10 10 Aufbau einer biologischen Membran Integrale Membranproteine  Amphiphatisch Hydrophober Anteil innerhalb der Membran  Verankerung durch Wechselwirkung mit Fettsäureketten Hydrophiler Anteil außerhalb der Membran  Wechselwirkungen mit der Umgebung Periphere Membranproteine  Nichtkovalente Bindungen an Membran bzw. Proteine Lipidverankerte Proteine  Kovalente Bindung an ein Lipid (z.B.: GPI-Verankerung)

11 11 Funktionen einer biologischen Membran Kompartimierung Selektive Permeabilität Transportvorgänge Signalaufnahme, Weiterleitung, Abgabe Ort der Energie- sowie Stoffumwandlung (Träger von Enzymen)

12 12 Fluid Mosaic Modell 1972 S.J. Singer und G.L. Nicolson Modell zum Aufbau der biologischen Membran  Flüssig-kristalline Lipiddoppelschicht (Hydrophile „Köpfe“ der Membranlipide  außen, Hydrophobe „Fettsäureschwänze“  innen)  Membranproteine inselartig eingelagert, lateral frei beweglich dynamische Struktur [7]

13 13 Fluid Mosaic Modell Membranfluidität  Lipidzusammensetzung  Cholesterinanteil (hoher Anteil  erhöhte Viskosität)  Temperatur Stabilität durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Fettsäureketten Wärmezufuhr: Übergang von kristallinem zu flüssig- kristallinem Zustand [8]

14 14 „Lipid Rafts“- Lipidflöße [9]

15 15 „Lipid Rafts“- Lipidflöße Unterscheiden sich in ihrer Zusammensetzung von anderen Membranbereichen  Sphingolipide  Cholesterin  Glycolipide  GPI-verankerte Proteine Stärker geordnet und dichter gepackt Caveolae  Ausbuchtungen der Membran  Caveolin als wichtigste Strukturelement hochdynamische Strukturen Zusammenlagerung Auflösung

16 16 Funktionen von Lipid Rafts [8]

17 17 Funktionen von Lipid Rafts [9]

18 18 Ergebnisdarstellung „Stomatin, flotillin-1, and flotillin-2 are major integral proteins of erythrocyte lipid rafts“ von Ulrich Salzer, Rainer Prohaska; blood ( : ) Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Lipid Rafts Verwendete Methoden  Isolation der Lipid Rafts aus Erythrozyten durch Extraktion  Gelektrophorese, Silberfärbung  Membranmarker: Acetylcholinesterase (AChE)  Western Blot

19 19 Ergebnisdarstellung A: diskontinuierliche Dichtegradientenzentrifugation (Spur 1: Pellet, Spur 2: hohe Dichte, Spur 3: mittlere Dichte, Spur 4: Lipid Rafts) B: Extraktion in alkalische Lösung (Na 2 CO 3 ) (Spur T: Suspension vor Extraktion, Spur S: Überstand, Spur P: Pellet) Stomatin, Flotillin-1 und -2  Integrale lipid raft assoziierte Membranproteine Protein 4.1 und 4.2, Spectrin, Actin  Periphere Membranproteine Methode AMethode B

20 20 Ergebnisdarstellung Immunblot der isolierten Lipid Rafts Oligomere Komplexbildung von Flotillin-1 und -2 sowie Stomatin Spur 1 und 2: Erythrozytenmembran eines OHSt krankem Patienten; Spur N: gesunde Person Stomatin ist nicht in Spur 1 und 2 nachweisbar (OHSt) OHSt: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis

21 21 Ergebnisdarstellung “Ca++-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin” von Ulrich Salzer, Peter Hinterdorfer, Ursula Hunger, Cordula Borken, Rainer Prohaska; blood ( : ) Erkenntnisse über die Bestandteile von Lipid Rafts sowie über die calciumabhängige Vesikulation Verwendete Methoden  Rasterkraftmikroskopie  Calciumabhängie Vesikulation  Trennung der Mikro- und Nanovesikel durch Zentrifugation  Gelektrophorese, Silberfärbung  Western Blot

22 22 Ergebnisdarstellung Methode A und B unterscheiden sich Zentrifugationsmethoden A) Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2: Mikrovesikel Spur 3: Nanovesikel B)Spur 1: Erythrozytenmembran Spur 2 und 3: Mikrovesikel Spur 4: Nanovesikel Stomatin in Mikrovesikel Synexin und Sorcin in Nanovesikel Carboanhydrase ( CA) und Hämoglobin (Hb) in beiden nachweisbar

23 23 Ergebnisdarstellung A sowie B: Auswirkung von Ca 2+ bzw. EDTA-Zugabe S: Überstand; P: Pellet nach Zentrifugation aq: aquatisch; dt: detergent nach Phasenseperation Synexin und Sorcin nach Ca 2+ Zugabe im Pellet, nach EDTA Zugabe im Überstand Stomatin: keine Auswirkungen Stomatin nach Phasenseperation durch Triton X-114 nur noch in der detergenten Phase

24 24 Ergebnisdarstellung Periphere Membranproteine  Durch hydrophobe Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrückenbindungen an Membran gebunden  Ablösen durch Veränderung des pH-Wertes, des Puffers, der Salzkonzentration (EDTA) Integrale Membranproteine  Ablösen durch Detergenz (Triton X-114) Stomatin  Integrales Membranprotein,  Cytoskelettanker beteiligt am Kationentransport (Na + /K + )  Abwesenheit: Overhydrated Hereditary Stomatocytosis Synexin  Peripheres, calciumbindendes Protein  Exozytoseprozesse, Membranfusion Sorcin  Peripheres, calciumbindendes Membranprotein  Signaltransduktion

25 25 Abbildungsverzeichnis [1]http://www.biokurs.de/skripten/bilder/membr3.jpg [2]Biochemie: Eine Einführung mit 40 Lerneinheiten von Philipp Christen,Rolf Jaussi, Springer (2005) [3] [4]http://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelinhttp://www.bioc.uzh.ch/blexon/s:sphingomyelin [5]http://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.htmlhttp://www.guidobauersachs.de/oc/lipide.html [6]Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [7]http://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singer- and-Nicholson-resized-150x150.jpghttp://www.rauhfasler.de/wp-content/uploads/2010/04/Fluid-mosaic-diagram-Singer- and-Nicholson-resized-150x150.jpg [8]http://www.uni-marburg.de/fb20/cyto/lehre/Jacob/membranen.pdf [9]Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [10]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.htmlhttp://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [11]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.htmlhttp://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html

26 26 Quellen [1]Biochemie der Ernährungvon Gertrud Rehner,Hannelore Daniel, Spektrum, 3. Auflage (2010) [2]Karlsons Biochemie und Pathobiochemie von Peter Karlson,Detlef Doenecke,Jan Koolman,Georg Fuchs,Wolfgang Gerok, Thieme, 15. Auflage (2005) [3]http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/transport/membranentrans port.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/transport/membran_aufbau_funktion.vscml.html [4]http://de.wikipedia.org/wiki/Lipide#Membranbildende_Lipide [5]www.lipidsignalling.de/lipidimfocus/sphingolipide.php [6]Biochemie von H. Robert Horton,Laurence A. Moran,K. Gray Scrimgeour,J. David Rawn,Marc D. Perry, Pearson Studium, 4. Auflage (2008) [7]Biochemie Zellbiologie von Katharina Munk, Thieme (2008) [8]Kurzlehrbuch Histologie von Norbert Ulfig, 3. Auflage, Thieme (2003) [9]Molekulare Zellbiologie von Gerald Karp,Sebastian Vogel,Susanne Kuhlmann-Krieg, Springer, 4. Auflage (2005) [10]www.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../ _p.pdfwww.deutscher-apotheker-verlag.de/.../tx.../ _p.pdf [11]http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304http://www.wissenschaft-online.de/abo/lexikon/biok/4304 [12]Taschenlehrbuch Biochemie von Gerd P. Püschel,Hartmut Kühn,Thomas Kietzmann,Wolfgang Höhne, Thieme (2011) [13]http://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a fullhttp://cshperspectives.cshlp.org/content/3/10/a full [14]http://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.htmlhttp://www.nature.com/nrn/journal/v8/n2/fig_tab/nrn2059_F2.html [15]http://www.fwf.ac.at/de/abstracts/abstract.asp?L=D&PROJ=P15486 [16]http://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.htmlhttp://www.nature.com/nrm/journal/v1/n1/fig_tab/nrm1000_031a_F1.html [17]http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907http://www.fwf.ac.at/de/finals/final.asp?L=D&PROJ=P12907 [18]http://www.uniprot.org/uniprot/P20073


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